Resistencia de Beauveria bassiana a luz ultravioleta

De Wikinsecta

Relación entre resistencia de Beauveria bassiana a la luz ultravioleta en condiciones de laboratorio y virulencia contra la broca del café en campo*

Sandra P. Valdés Gutiérrez1, Angela B. Cárdenas2, Carmenza E. Góngora3
1Investigadora Asociada. Disciplina de Entomolo, Cenicafé, CENICAFE. Planalto. Km 4, vía antigua a Manizales, Chinchiná. Caldas. sandra.valdes@cafedecolombia.com 2Investigadora Asociada. angela.cardenas@cafedecolombia.com 3Investigadora Científica III, carmenza.gongora@cafedecolombia.com

El hongo entomopatógeno Beauveria bassiana presenta un gran potencial como controlador biológico de
insectos; sin embargo, la eficacia de este microorganismo depende en gran parte de su persistencia en condiciones
de campo que se ve afectada por la radiación solar, particularmente por las longitudes de ondas
UV-A y UV-B. En estudios realizados en condiciones de laboratorio y campo se ha encontrado que existe
una mayor mortalidad en laboratorio causada por la mezcla de cepas de baja virulencia (Bb 9001, Bb9024 y
Bb9119), comparada con la cepa Bb9205 de alta virulencia; sin embargo, en condiciones de campo tanto la
mezcla como la cepa Bb 9205 presentaron un porcentaje de mortalidad altos. Con el propósito de conocer
cuáles son las posibles causas para dicho comportamiento se realizó una evaluación de resistencia a luz UV
de cepas de B. bassiana entre las que se evaluaron tres cepas ARSEF (Bb718, Bb1053 y Bb2997), las cepas
de baja virulencia individualmente (Bb 9001, Bb9024 y Bb9119), la mezcla de éstas, la cepa Bb 9112.GFP
transformada con el gen de la proteína verde fluorescente, y la cepa Bb 9205 de alta virulencia. Todas fueron
sometidas consecutivamente a luz UV-A, UV-B y luz visible por un período de 15 min, y se encontró un
mayor porcentaje de resistencia a luz UV con la cepa Bb 9205 que con la mezcla de baja patogenicidad, lo
que quizá está favoreciendo a dicha cepa, de tal manera que presente un porcentaje de mortalidad similar
a la mezcla en condiciones de campo. Este trabajo ha sido cofinanciado por el Ministerio de Agricultura y
Desarrollo Rural.


  • Publicado en: Resúmenes Sociedad Colombiana de Entomología (Socolen) XXVIII Congreso, Cali, Colombia, julio 16 - 18 de 2008.

EVALUACIÓN EN CAMPO DE UN AISLAMIENTO DE Beauveria bassiana SELECCIONADO POR RESISTENCIA A LA LUZ ULTRAVIOLETA

Sandra Patricia Tobar-H*. Patricia Eugenia Vélez-Arango**; Esther Cecilia Montoya-Restrepo**.
* Universidad Católica de Manizales. Apartado aéreo 357. sptobar@ucatolicamz.edu.co
** Investigador Científico I. Entomología y Biometría, respectivamente. Centro Nacional de Investigaciones de Café,
Cenicafé. Chinchiná, Caldas, Colombia.

RESUMEN


TOBAR H., S.P.; VÉLEZ A., P. E.; MONTOYA R., E.C.Evaluación en campo de un aislamiento de
Beauveria bassiana seleccionado por resistencia a la luz ultravioleta. Cenicafé 50(3): 195-204. 1999.


Se seleccionó el aislamiento B. bassiana 9218 resistente a todos los períodos de exposición a la luz
ultravioleta, LUV para evaluar en el campo el porcentaje de mortalidad de broca por acción del hongo,
viabilidad del hongo (UFC/ml) y tasa de reducción de la viabilidad del hongo al cabo de 30 días, en una zoca
de café de la variedad Colombia. Se realizó un seguimiento de las variables exógenas humedad relativa,
temperatura y radiación solar global. El análisis estadístico mostró efecto de tratamientos, a favor de B.
bassiana 9218 RLUV, la formulación comercial presentó la más baja mortalidad y el testigo absoluto
mostró promedios bajos en la mayoría de los tiempos. El mayor efecto del hongo se evidenció a los 30 días,
con porcentajes de mortalidad de broca del 20,6%. El análisis mostró efecto de tratamientos para la variable
viabilidad, siendo el mejor B. bassiana 9218 RLUV con una menor reducción de UFC/ml al final de la
evaluación (30 días). Los resultados muestran el efecto de regulación de poblaciones de la broca (21%)
ejercido por un aislamiento seleccionado por resistencia a la LUV.

Palabras claves: Resistencia, luz ultravioleta, mortalidad, viabilidad, cafetales, Beauveria bassiana.
Sandra Patricia Tobar-H*. Patricia Eugenia Vélez-Arango**; Esther Cecilia Montoya-Restrepo**.


ABSTRACT
Beauveria bassiana isolate 9218, which is resistant to all exposure periods to ultraviolet light, was selected
to perform a field evaluation of coffee berry borer mortality, fungus viability (cfu/ml), and fungus rate of
viability reduction after 30 days in a Colombia cultivar coffee prunned. Relative humidity, temperature and
global solar radiation were monitored. Statistical analysis indicated differences among treatments, with a
good performance of B. bassiana 9218 RLUV. The commercial formulation showed the lowest mortality
and the absolute control showed low averages most of the time. The highest fungus effect was observed
after 30 days, with coffee berry borer mortalities of 20.6%. There were also differences among treatments
in viability, and the best treatment was B. bassiana 9218 RLUV with the lowest reduction of cfu/ml at the
end of the evaluation (30 days). Results indicate a certain degree of regulation of coffee berry borer
populations with the isolate selected by UV light resistance.

Keywords: Resistance, ultraviolet light, mortality, viability, field, Beauveria bassiana


Cenicafé, 50(4): 327-337. 1999 327
RESUMEN
TOBAR H., S.P.; VÉLEZ A., P.E.; MONTOYA R., E.C. Selección en laboratorio de aislamientos de
Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae por resistencia a la luz ultravioleta. Cenicafé 50(4): 327-
337. 1999.
Se evaluó el efecto de la LUV sobre la viabilidad (UFC/ml) y la tasa de crecimiento (CD) de Beauveria
bassiana y Metarhizium anisopliae y se determinó la actividad enzimática y la patogenicidad de los
aislamientos irradiados sobre la broca del café. Se encontraron diferencias entre tratamientos (P=0,05) para los
aislamientos no irradiados, en la variable UFC/ml, a favor de M. anisopliae 9303 y de B. bassiana 9002, 9012,
9212, 9218 y 9205. Todos los aislamientos irradiados presentaron reducciones en su viabilidad mayores del
90%, independientemente del tiempo de exposición al efecto. La tasa diaria de CD mostró diferencias entre los
aislamientos no irradiados a favor de M. anisopliae 9303, 9218, 9233 y de B. bassiana 9002, 9012, 9021,
9027, 9212, 9218. Cuando los aislamientos fueron sometidos a la LUV, en general, no presentaron CD, a
excepción de los aislamientos M. anisopliae 9303 y B. bassiana 9218. La evaluación enzimática de los
aislamientos irradiados mostró una mayor actividad en la mayor parte de los sustratos evaluados, especialmente
en los aislamientos Ma 9303 y Bb9218. Así mismo, los aislamientos irradiados presentaron una reducción en
el porcentaje de mortalidad de broca, el cual pasó de un 80% a un 40%. Se concluye que aún cuando la LUV
(254nm) es letal para la viabilidad de estos hongos, el método empleado permitió seleccionar una población
de propágulos resistentes al efecto de la LUV, los cuales incrementaron su actividad enzimática como respuesta
al agente mutagénico.
Palabras claves: Luz ultravioleta, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, resistencia,
Hypothenemus hampei.
1 Fragmento del trabajo “ Selección de aislamientos de Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin y Metarhizium anisopliae
(Metschnikoff) Sorokin por resistencia a la luz ultravioleta” presentado a la Universidad Católica de Manizales como
requisito para optar al titulo de especialista en Microbiología. Manizales.
* Estudiante de Especialización en Microbiología
** Investigador Científico I, Entomología y Biometría, respectivamente. Centro Nacional de Investigaciones de Café, Cenicafé.
Chinchiná, Caldas, Colombia.
SELECCIÓN EN LABORATORIO DE AISLAMIENTOS DE Beauveria bassiana y
Metarhizium anisopliae POR RESISTENCIA A LA LUZ ULTRAVIOLETA1
Sandra Patricia Tobar-Hurtado*; Patricia Eugenia Vélez-Arango**; Esther Cecilia Montoya-Restrepo**.
ABSTRACT
The effect of UV light on the viability (UFC/ml) and diametral colony growth (DG) of Beauveria bassiana
and Metarhizium anisopliae was evaluated, and enzymatic activity and pathogenicity on coffee berry borer
of irradiated isolates was determined. There were differences among treatments (P=0.05) for the nonirradiated
treatments in variable CFU/ml in favor of M. anisopliae 9303 and B.bassiana 9002, 9012, 9212, 9218,
and 9205. All irradiated isolates showed reductions over 90% in their viability, independent from the
exposition time. Daily rate of DG showed differences among the non-irradiated isolates in favor of M.
anisopliae 9303, 9218, 9233, and B.bassiana 9002, 9012, 9021, 9027, 9212, 9218. When isolates were subjected
to UV light, in general, they did not show DG, except for isolates M anisopliae 9303 and B.bassiana 9218.
Enzymatic evaluation of irradiated isolates showed a higher activity in the majority of the substrates
evaluated, especially in isolates Ma9303 and Bb 9218. Likewise, irradiated isolates showed a reduction in the
percentage of coffee berry borer mortality, from 80% to 40%. Even though UV light (254nm) is lethal for these
fungi, the method used allowed selection of resistant propagules to UV light, which increased their enzymatic
activity as a response to the mutagenic agent.
Keywords: Ultraviolet light, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, resistance, Hypothenemus
hampei.
328 Cenicafé, 50(4): 327-337. 1999
La broca del café Hypothenemus hampei
(Ferrari) es el insecto más dañino que afecta la
caficultura en Colombia; su daño se refleja en la
destrucción y caída de frutos verdes y maduros.
Los frutos brocados que quedan en el árbol no
sólo reducen el rendimiento sino que demeritan
la calidad del café (4).
Actualmente el control de la broca se realiza
a través de un programa de Manejo Integrado de
plagas (MIP), el cual involucra diferentes tipos
de control. Dentro de ellos se encuentra el
control biológico mediante el uso de los hongos
entomopatógenos Beauveria bassianay Metarhizium
anisopliae (1).
Con relación al uso del hongo B. bassiana
como agente de control biológico, no es frecuente
observar altos porcentajes de infección del
hongo sobre la broca del café en condiciones de
campo, lo cual puede atribuirse a factores de
tipo exógeno presentes en el ecosistema cafetero
como la alta temperatura, la humedad y la
radiación solar que incluye rayos ultra violeta
(UV). El componente UV de la luz solar puede
inactivar los hongos entomopatógenos reduciendo
su persistencia en el campo. Dicha acción
se realiza en forma directa a través de
delecciones, uniones cruzadas, ruptura de bandas
y formación de sitios lábiles en la molécula
de ADN, debido a que los ácidos nucleicos
absorben la luz ultravioleta, que se localiza por
debajo de la luz visible (210nm y 400nm).
En forma indirecta, esta radiación puede
formar radicales altamente reactivos, de manera
que la población tolerante a estos efectos
puede presentar mutaciones en cuanto a la
resistencia a los bacteriófagos, capacidad de
fermentación o capacidad de sintetizar una sustancia,
etc., lo que generalmente la hace diferente
de la población original porque surgen
modificaciones en su fisiología y genética produciendo
mutantes que generalmente difieren
de la población original (2, 7).
Paralelamente, De Duve (5), afirma que la
luz ultravioleta es uno más de los múltiples
agentes que pueden alterar el ADN al igual que
los rayos X, las emisiones radiactivas, los radicales
libres, los productos químicos, ciertas
enzimas y errores en la replicación. Es así como
el ADN se halla expuesto a diferentes tipos de
lesión, las hebras pueden romperse o las bases
perderse por hidrólisis, alterarse químicamente,
emparejarse mal o unirse por enlaces
covalentes; de una manera directa el principal
efecto producido por la LUV es la dimerización
de la timina, uniendo dos residuos adyacentes
de ésta en una cadena de ADN sencillo, por
medio de un anillo ciclobutilo, originando
sobrecruzamientos, de modo que las sustancias
intercaladoras pueden deslizarse entre los pares
de bases adyacentes y dislocar la hélice del
ADN.
Aunque las células tienen mecanismos de
reparación, en la mayoría de los casos las lesiones
resultan irreversibles. Sin embargo, es probable
que ninguna de las lesiones inducidas por
la luz ultravioleta sea mutagénica, lo cual indica
que el efecto mutacional de la LUV tiene lugar
durante la reparación del ADN y no como
primera consecuencia de la radiación (3).
Con el fin de inducir mutaciones como una
técnica para el mejoramiento de microorganismos,
se ha utilizado ampliamente la luz
ultravioleta en la investigación, ya que es de
fácil manipulación y es un agente cuantificable
(3, 11).
Actualmente existen en el cepario del laboratorio
de patología de insectos de Cenicafé 92
aislamientos de B. bassiana (Bb) y 52 aislamientos
de M. anisopliae (Ma) provenientes de
diferentes regiones geográficas e insectos hospedantes,
los cuales representan genotipos
promisorios para el control biológico de plagas
de importancia económica, no sólo en el café
sino en otros cultivos. En estos aislamientos no
Cenicafé, 50(4): 327-337. 1999 329
se ha llevado a cabo una selección en laboratorio
por resistencia a la luz ultravioleta, factor de
tipo abiótico que limita el crecimiento y desarrollo
de estos hongos en el campo. Por tal
razón, el presente trabajo tuvo como objetivo
principal seleccionar en laboratorio aislamientos
de Bb y Ma resistentes a diferentes tiempos
de exposición a la luz ultravioleta, con una
buena actividad enzimática y un alto porcentaje
de patogenicidad a la broca del café, para ser
utilizados en programas de manejo integrado
del insecto.
MATERIALES Y MÉTODOS
El trabajo experimental se llevó a cabo en los
laboratorios de la Disciplina de Entomología,
en el Centro Nacional de Investigaciones de
Café, Cenicafé. Los aislamientos utilizados en
el presente estudio provenían de diferentes órdenes
de insectos y se seleccionaron según su
alta capacidad biocontroladora sobre la broca
demostrada en estudios previos realizados en
Cenicafé por González et al. (6). Estos aislamientos
reactivados en broca de café se conservaron
en Glicerol al 10% con una concentración
de 1x106 esporas/ml y un volumen de 1ml, a una
temperatura de -25°C. Los aislamientos evaluados
fueron Bb 9002; Bb 9012, Bb 9021, Bb
9027, Bb 9204, Bb 9205, Bb 9212, Bb 9218 y Bb
9301 y Ma 9201, Ma 92189, Ma 9233, Ma 9236
y Ma 9303.
Dichos aislamientos provienen de hospedantes
variables, los cuales se relacionan en la
Tabla 1, así como su mortalidad expresada en
porcentajes de patogenicidad sobre la broca del
café superior al 79%.
Reactivación de los aislamientos. Para obviar
la pérdida de patogenicidad de los aislamientos
de Bb y Ma a través de los subcultivos se
reactivaron en brocas adultas recién emergidas
provenientes de la Unidad de cría de Cenicafé,
con el fin de potenciar su patogenicidad al
insecto. Para este propósito se utilizó el
método estandarizado por González et al.
(6).
TABLA 1. Relación de aislamientos de Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae seleccionados para el estudio, con
porcentajes de patogenicidad sobre la broca del café superiores al 79%.
AISLAMIENTO PATOGENICIDAD HOSPEDANTE
%
GÉNERO ESPECIE ORDEN FAMILIA
Bb 9301 93,3 Rhynchoporus palmarum COLEOPTERA CURCULIONIDAE
Bb 9012 91,7 Hypothenemus hampei COLEOPTERA SCOLITYDAE
Bb 9021 91,7 Hypothenemus hampei COLEOPTERA SCOLITYDAE
Bb 9205 90,0 Diatraea saccharalis LEPIDOPTERA PYRALIDAE
Bb 9027 90,0 Nilaparvata lugens HOMOPTERA DELPHACIDAE
Bb 9204 90,0 Antaeotricha sp LEPIDOPTERA STENOMIDAE
Bb 9212 86,7 Hypothenemus hampei COLEOPTERA SCOLITYDAE
Bb 9002 83,3 Hypothenemus hampei COLEOPTERA SCOLITYDAE
Bb 9218 81,7 Cosmopolites sordidus COLEOPTERA CURCULIONIDAE
Ma 9201 92,5 Nemocestes incomptus COLEOPTERA CURCULIONIDAE
Ma 9236 87,5 Desconocido
Ma 9218 85,0 Teleogryllus comodus ORTHOPTERA GRYLLIDSE
Ma 9233 80,0 Saltahojas HOMOPTERA CICADELLIDAE
Ma 9303 92,5 Hypothenemus hampei COLEOPTERA SCOLITYDAE
330 Cenicafé, 50(4): 327-337. 1999
Exposición a la luz ultravioleta. A partir de los
aislamientos reactivados en broca cultivados en
SDA durante aproximadamente 10 días, incubados
a 21-25°C, se prepararon suspensiones de
conidias en Glicerol al 10% para cada uno de los
aislamientos, para lo cual se realizaron diluciones
sucesivas (10-1,10-2 y10-3). A partir de la
dilución 10-3 se realizaron seis recuentos en
cámara de Neubauer y una vez obtenida la
concentración, a partir del promedio de las
lecturas realizadas, se procedió a obtener las
suspensiones de concentración 1x106 esporas/
ml (10). Con una pipeta esterilizada se colocó
1ml de la suspensión en 3 beakers esterilizados
de 50ml los cuales fueron irradiados en una
cámara de flujo laminar con una lámpara de luz
ultravioleta de 15watt de potencia, cuya emisión
fue de 254nm y a una distancia de 25cm.
Dicha exposición se realizó en tres tiempos: 10,
30 y 60 minutos. De igual manera se tuvo un
tratamiento testigo sin exposición.
Una vez concluido el proceso de irradiación
se procedió a inocular 0,1ml y 5 microlitros de
esta suspensión en cajas de petri con SDA
con el fin de evaluar las variables UFC/ml y
Crecimiento diametral (CD) en milímetros,
a los 29 días de la siembra, respectivamente.
Diseño experimental. El efecto de los aislamientos
se estimó bajo un modelo de análisis
completamente aleatorizado para las variables
UFC/ml y CD. Para la variable UFC/ml se
utilizaron 10 repeticiones por cada aislamiento
partiendo del mismo medio de cultivo inicial
con el aislamiento esporulado de cada uno de los
hongos, donde la unidad experimental fue la
caja de Petri. Para la variable CD se utilizaron
10 repeticiones partiendo del mismo medio de
cultivo inicial. La tasa diaria de crecimiento
diametral se estimó para cada una de las unidades
experimentales de acuerdo con un modelo
de regresión lineal simple, con coeficientes de
determinación mayores del 80%.
Actividad enzimática. A los aislamientos que
luego de ser sometidos a diferentes tiempos de
exposición a la LUV presentaron una población
de propágulos tolerantes a este efecto, se les
determinó su actividad enzimática utilizando el
sistema comercial ApiZym, el cual consiste en
microcápsulas que contienen sustratos
cromógenos de enzimas deshidratadas y tampón.
Estos sustratos permiten la detección de 19
enzimas: fosfatasa alcalina, esterasa (C1),
esterasa lipasa (C8), lipasa (C14), leucina
arilamidasa, valina arilamidasa, cistina
arilamidasa, tripsina, alfa quimotripsina,
fosfatasa ácida, naftol-A-S-BI-fosfohidrolasa,
alfa galactosidasa, beta galactosidasa, beta
glucoronidasa, alfa glucosidasa, beta
glucosidasa, N-acetil-B-glucosaminidasa, alfa
manosidasa y alfa fucosidasa.
La actividad enzimática de estos hongos
resistentes al efecto de la LUV se evaluó luego
de haberlos cultivado en agar agua y agarsaboureaud,
bajo los mismos parámetros de
inoculación, comparándolos con los patrones
enzimáticos de los aislamientos que no fueron
sometidos al efecto de la LUV, los cuales se
utilizaron como testigos. Para la inoculación se
tomaron 65 microlitros de la suspensión del
hongo irradiado con una concentración de 1x106
esporas/ml y se depositaron en las cámaras de
inoculación donde se incubaron durante cuatro
horas a 37°C; transcurrido este tiempo se adicionó
una gota de reactivo zym A y una gota de
zym B en cada microcápsula, según las especificaciones
de la prueba. La lectura de la reacción
se realizó mediante una escala de 0 a 5 definida
según la intensidad del color, donde 0 equivale
a una reacción negativa, 1, reacción débilmente
positiva, 2,3 y 4 a una reacción moderadamente
positiva y 5 a una reacción fuertemente positiva.
Para la evaluación se realizaron dos lecturas,
una a los 30 minutos y otra a las 16 horas de
iniciada la reacción, según el método estandarizado
por Valdés et al. (9).
Cenicafé, 50(4): 327-337. 1999 331
Bioensayo de patogenicidad. Para la evaluación
de la patogenicidad sobre la broca del café,
se cultivaron los aislamientos irradiados en
SDA, durante 30 días y, a partir de allí, se tomó
el inóculo. Por cada aislamiento se utilizaron 5
unidades experimentales que contenía cada una,
15 brocas con cuatro repeticiones, según el
método estandarizado por González et al.,(6).
Como testigos se tuvieron un tratamiento conformado
por adultos de broca que no estuvieron
en contacto con el hongo y un testigo tratado con
los aislamientos no irradiados.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Efecto de la luz ultravioleta sobre la viabilidad
de los aislamientos. El análisis de varianza
de los aislamientos no sometidos al efecto de la
luz ultravioleta, mostró diferencias estadísticas
entre ellos; el aislamiento Ma 9303 presentó
una menor tasa de reducción de UFC/ml (Figura
1), seguido de los aislamientos Bb 9002, Bb
9012, Bb 9218 y Bb 9205. En cuanto a la
variable tasa de reducción de UFC/ml de los
aislamientos, luego de ser irradiados, se presentaron
reducciones superiores al 98% (Tabla 2),
con respecto al los no irradiados e independientemente
de los tiempos de exposición evaluados.
Entre los aislamientos que presentaron una
menor tasa de reducción de UFC/ml se destacan:
Bb 9218 y Ma 9303.
Efecto de la luz ultravioleta sobre el crecimiento
diametral (CD). El análisis de varianza
para la tasa diaria de crecimiento de los hongos
no sometidos a la luz ultravioleta mostró diferencias
significativas entre éstos a favor de los
aislamientos Ma 9303, Ma 9218 y Ma 9233 y de
los aislamientos Bb 9002, Bb 9012, Bb 9021, Bb
9027, Bb 9212 y Bb 9218. La mayoría de los
aislamientos sometidos al efecto de la luz
ultravioleta no presentaron crecimiento, a excepción
de los aislamientos Ma 9303 y Bb 9218
(Tabla 3).
Al evaluar la respuesta de estas dos variables
se puede concluir que la luz ultravioleta ejerce
Figura 1.
Unidades
formadoras de
colonia de un
aislamiento de
Metarhizium
anisopliae
sometido a la luz
ultravioleta
durante diferentes
tiempos de
exposición.
TIEMPOS EXPOSICIÓN LUV (Ma 9303)
DILUCIÓN 10-1
30' 60'
0' 10'
332 Cenicafé, 50(4): 327-337. 1999
TABLA 2. Promedio de unidades formadoras de colonia por mililitro (UFC/ml) y Tasa relativa de reducción en la viabilidad
de los diferentes aislamientos de Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae sometidos a diferentes tiempos de
exposición a la luz ultravioleta, con respecto a los aislamientos no irradiados.
AISLAMIENTO TIEMPO DE EXPOSICIÓN
CODIGO UFC/ml 10 minutos 30 minutos 60 minutos
Tasa (%) Tasa (%) Tasa (%)
Bb 9002 186437,67b* 99,76a 99,75bc 99,99a
Bb 9012 145085,00b 99,99a 100e 100e
Bb 9021 16630,00bcd 99,80a 100e 100e
Bb 9027 84474,13bc 99,99a 99,99a 100e
Bb 9204 24509,53bcd 100e 100e 100e
Bb 9205 133778,67bc 99,99a 100e 100e
Bb 9212 89878,47bc 99,74a 99,96a 100e
Bb 9218 134436,00bc 98,55b 99,75ac 99,94ac
Bb 9301 75490,44bcd 100e 100e 100e
Ma 9201 71479,03bcd 100e 100e 100e
Ma 9218 14396,57bcd 99,99a 100e 100e
Ma 9233 62234,43bcd 99,99a 100e 100e
Ma 9236 21748,20bcd 100e 100e 100e
Ma 9303 268252,63a 98,11b 99,63b 99,89bc
* Promedios seguidos por letras diferentes, en la misma columna, difieren estadísticamente según prueba de Tukey al 5%.
TABLA 3. Tasa diaria de crecimiento diametral (CD) de aislamientos de Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae,
sometidos a diferentes tiempos de exposición a la luz ultravioleta.
TIEMPO O Min 10 Min 30 Min 60 Min
AISLAMIENTO X (mm) X(mm) X(mm) X(mm)
Bb 9002 0,18518b* 0,028a 0,015a 0,00a
Bb 9012 0,24885a 0,082a 0,015a 0,00a
Bb 9021 0,29473a 0,050a 0,00b 0,00a
Bb 9027 0,29473a 0,046a 0,00b 0,00a
Bb 9204 0,15252b 0,00b 0,00b 0,00a
Bb 9205 0,18236b 0,00b 0,00b 0,00a
Bb 9212 0,24528a 0,034a 0,011a 0,00a
Bb 9218 0,27136a 0,053a 0,039a 0,015a
Bb 9301 0,26979a 0,00b 0,00b 0,00a
Ma 9201 0,23929b 0,00b 0,00b 0,00a
Ma 9218 0,20468b 0,016a 0,00b 0,00a
Ma 9233 0,19567b 0,035a 0,00b 0,00a
Ma 9236 0,18860b 0,00b 0,00b 0,00a
Ma 9303 0,20982b 0,039a 0,018a 0,017a
* Promedios seguidos por letras diferentes, en la misma columna, difieren estadísticamente según prueba de Tukey al 5%.
Cenicafé, 50(4): 327-337. 1999 333
una acción letal sobre estos hongos, sin embargo,
el método empleado en laboratorio permitió
seleccionar una población de individuos tolerantes
al efecto de la luz ultravioleta, los cuales
se utilizaron en evaluaciones posteriores.
Efecto de la luz ultravioleta sobre la actividad
enzimática. Con relación a los sustratos en
los cuales se realizó la evaluación enzimática de
los aislamientos se pudo observar una mayor
reacción enzimática cuando fueron cultivados
en el sustrato agar-agua (Tablas 4 y 6), con
relación al sustrato SDA (Tablas 5 y 7). Por
dicha razón sólo se referirán los resultados
obtenidos en el sustrato agar-agua. En general,
para la mayoría de los aislamientos evaluados se
presentó un incremento de la actividad en la
mayor parte de las enzimas después de la irradiación,
especialmente en los aislamientos Ma
9303 y Bb 9218, los cuales presentaron mayores
reacciones colorimétricas en la prueba
enzimática. Es el caso del aislamiento Bb 9218,
en el que las enzimas fosfatasa ácida y naftol AS-
BI fosfohidrolasa, aumentaron su reacción en
función del tiempo de exposición, con relación
a los aislamientos no irradiados. El aislamiento
Bb 9002 presentó igual respuesta para las
enzimas fosfatasa ácida y naftol A-S-BI
fosfohidrolasa y los aislamientos Bb 9027 y Bb
9212 presentaron reacción en las enzimas
fosfatasa ácida, naftol A-S-BI fosfohidrolasa,
fosfatasa alcalina y beta glucosidasa, al ser
sometidos a la luz ultravioleta, mientras que
el aislamiento no irradiado no presentó actividad
en las enzimas mencionadas (Figura
2).
Con respecto a M. anisopliae, el aislamiento
Ma 9303 presentó un incremento en la actividad
de las enzimas fosfatasa ácida, naftol AS-
BI fosfohidrolasa, alfa galactosidasa, beta
glucosidasa, N- acetil beta glucosidasa, luego
de la irradiación, con respecto al aislamiento no
irradiado. Adicionalmente, las enzimas beta
galactosidasa, beta glucoronidasa y alfa
fucosidasa sólo se evidenciaron en este aislamiento
irradiado y fueron negativas en el testigo.
El aislamiento Ma 9218 presentó un incremento
en la actividad de las enzimas fosfatasa
ácida, naftol A-S-BI fosfohidrolasa y alfa
galactosidasa, en función del tiempo de exposición.
En el aislamiento Ma 9233 se presentó
disminución de la actividad enzimática con
respecto al aislamiento no irradiado, a medida
que aumentó el tiempo de exposición para las
enzimas fosfatasa alcalina, esterasa, esterasa
lipasa, leucina, beta glucosidasa y N- acetil beta
glucosidasa (Figura 3).
Efecto de la luz ultravioleta sobre la patogenicidad
del hongo B. bassiana sobre la broca
del café. Esta variable se evaluó en los aislamientos
seleccionados en laboratorio por su
resistencia a períodos de exposición a la luz
ultravioleta de 30 y 60 minutos (Tabla 8). En
general, se observó que la patogenicidad se
redujo de un 80 a un 40%, en los aislamientos
irradiados.
Se destacan los aislamientos: Ma 9303 con
un porcentaje de patogenicidad del 60%, el
aislamiento Bb 9218 con un porcentaje de patogenicidad
del 55% y el aislamiento Bb 9002 con
un porcentaje de patogenicidad del 42,5%, luego
de 60 minutos de exposición a la luz
ultravioleta.
Se concluye que la luz ultravioleta ejerce
una acción letal sobre los hongos B. bassiana y
M. anisopliae; sin embargo, el método empleado
permitió seleccionar una población de individuos
tolerantes a este efecto, los cuales a pesar
de presentar reducciones en su viabilidad y
patogenicidad sobre la broca del café, mostraron
un incremento en la actividad enzimática.
Tal respuesta se podría atribuir al efecto directo
de la luz ultravioleta sobre el ADN de estos
agentes biológicos, de modo que se modifica su
actividad enzimática como respuesta a la acción
del mutágeno, quizas como un mecanismo de
adaptación de estos microorganismos a las condiciones
adversas del medio.
334 Cenicafé, 50(4): 327-337. 1999
TABLA 5. Caracterización enzimática de aislamientos patogénicos de Metarhizium anisopliae resistentes a diferentes tiempos de exposición a la luz ultravioleta, por el sistema
comercial Api-zym, en el sustrato Saboureaud-dextrosa-agar. Lectura a los 30 min y 16 h de reacción.
Aislamiento Enzima Fosfat Lipasas Proteasas Fosfatasas Galactos Glucos Gluco Manos
Fosfat Ester Ester Lipasa Leucin Valina Tripsi Fosfat Na.-A- alfa Beta Beta N-acetil Alfa
Tiempo Alcal C1 lipa C14 arilam Arilam ácida S-Bl-. galac Galac Glucos. Betaglu Manos
9303 0 min 1 – 1 3 - 4 2 - 2 0 - 0 2 - 2 0 - 1 0 - 0 4 - 5 4 - 5 0 - 0 0 - 0 2 - 3 1 – 1 0 - 0
10 min 1 – 1 2 - 4 2 - 3 0 - 0 1 - 2 0 - 1 0 - 0 4 - 5 4 - 5 0 - 0 1 - 2 2 - 3 1 – 1 0 - 0
30 min 1 – 1 2 - 4 1 - 2 0 - 0 1 - 2 0 - 2 0 - 0 4 - 5 4 - 5 0 - 0 2 - 2 2 - 2 1 – 1 0 - 0
60 min 1 – 1 2 - 4 1 - 2 0 - 0 1 - 1 0 - 2 0 - 0 5 - 5 5 - 5 0 - 0 2 - 3 4 - 4 1 – 2 0 - 0
9233 0 min 2 – 3 3 - 4 2 - 3 0 - 0 3 - 4 0 - 1 1 - 1 3 - 4 4 - 5 3 - 4 1 - 2 3 - 5 3 – 5 0 - 1
10 min 1 – 1 2 - 2 1 - 1 0 - 2 1 - 1 0 - 1 0 - 0 4 - 5 4 - 5 0 - 0 0 - 1 1 - 1 0 – 1 0 - 0
30 min 1 – 2 3 - 5 2 - 2 0 - 0 0 - 2 0 - 2 0 - 0 5 - 5 5 - 5 0 - 0 0 - 0 1 - 1 0 – 0 0 - 0
TABLA 4. Caracterización enzimática de aislamientos patogénicos de Metarhizium anisopliae resistentes a diferentes tiempos de exposición a la luz ultravioleta, por el sistema
comercial Api-zym, en el sustrato agar-agua. Lectura a los 30 min. y 16 h de reacción.
Aislamiento Enzima Fosfat. Lipasas Proteasas Fosfatasas Galacto Glucor Gluco Glucos Manos Fuco
Fosf. Ester Ester Lip Leuc Val Trip Fosfat. Na.- alfa Beta Beta Beta N-ac.- alfa alfa
Tiempo alcal C1 Lipa C14 Arilam arilam Ácida S-Bl- galac. galac Gluco Glucos gluc manos Fuco
9303 0 min 1 - 1 3 - 4 2 - 4 0 - 0 3 - 4 0 - 1 0 - 0 4 - 5 4 – 5 3 - 4 0 - 0 0 - 0 1 – 3 1 - 2 0 - 0 0 – 0
10 min 1 - 2 4 - 5 2 - 4 0 - 0 3 - 4 0 - 0 0 - 0 5 - 5 5 – 5 3 - 4 5 - 5 0 - 0 2 – 3 2 - 2 0 - 0 1 – 2
30 min 1 - 1 3 - 4 2 - 3 0 - 0 2 - 2 0 - 1 0 - 0 4 - 5 4 – 5 4 - 4 5 - 5 0 - 0 3 – 4 2 - 3 0 - 0 1 – 1
60 min 1 - 2 4 - 5 3 - 4 0 - 0 4 - 5 0 - 0 0 - 0 5 - 5 5 – 5 4 - 4 5 - 5 0 - 0 4 – 4 2 - 2 0 - 0 3 – 4
9233 0 min 3 - 4 3 - 4 3 - 4 0 - 0 3 - 4 0 - 1 1 - 1 4 - 5 4 - 5 3 - 4 1 - 2 0 - 0 3 – 5 3 - 5 0 - 1 0 – 0
10 min 1 - 2 4 - 5 3 - 4 0 - 2 2 - 5 0 - 2 0 - 0 5 - 5 4 - 5 0 - 0 3 - 5 0 - 1 1 – 2 0 - 1 0 - 0 0 – 0
30 min 1 - 1 3 - 4 1 - 2 0 - 0 0 - 1 0 - 1 0 - 0 3 - 4 3 - 4 0 - 0 1 - 1 0 - 0 1 – 1 0 - 0 0 - 0 0 – 0
La primera columna equivale a la lectura realizada a los 30 minutos y la segunda lectura a las 16 horas.
Escala de reacción: 0= reacción negativa, 1= reacción débil, 2,3 y 4= reacción moderada, 5= reacción fuertemente positiva.
Enzimas= Fosfatasa alcalina, Esterasa, Esterasa lipasa, Leucina arilamidasa, Valina arilamidasa, Cistina arilamidasa, Tripsina, Alfa quimotripsina, Fosfatasa ácida, Naftol-A-SBI-
fosfohidrolasa, Alfa galactosidasa, Beta galactosidasa, Beta glucoronidasa, Alfa glucosidasa, Beta glucosidasa, N-acetil-beta-glucosaminidasa, Manosidasa, Fucosidasa
Cenicafé, 50(4): 327-337. 1999 335
TABLA 6. Caracterización enzimática de aislamientos patogénicos de Beauveria bassiana resistentes a la exposición a la luz
ultravioleta, por el sistema comercial Api-zym, en el sustrato agar agua. Lectura a los 30 min y 16 h de reacción.
Aislamiento Enzima Fosfa Lipasas Proteasas Fosfatasas Galact Gluco
Fosfa Ester Ester Lipa Leuci Valin Alfa Fosfat Na.-A- beta Beta
Tiempo Alcali C1 Lipa C14 arilam Arila Quim ácida S-Bl- galac Gluco
9002 0 min 0 – 0 0 - 1 0 - 1 0 - 0 0 - 1 0 - 1 0 - 0 0 - 1 0 - 1 0 - 0 0 – 1
10 min 0 – 0 1 - 1 0 - 1 0 - 1 0 - 1 0 - 0 0 - 0 1 - 2 1 - 2 0 - 0 0 – 0
30 min 0 – 0 1 - 2 1 - 1 0 - 1 0 - 1 0 - 0 0 - 0 2 - 3 0 - 0 0 - 0 0 – 0
60 min 0 – 0 2 - 2 0 - 1 0 - 1 0 - 1 0 - 1 0 - 0 3 - 4 3 - 4 0 - 0 0 – 0
9012 0 min 0 – 0 0 - 1 0 - 1 0 - 0 0 - 0 0 - 1 0 - 0 0 - 1 1 - 1 0 - 0 0 – 1
10 min 0 – 0 0 - 0 1 - 2 0 - 0 0 - 0 1 - 2 0 - 0 2 - 2 1 - 2 0 - 0 1 – 2
9021 0 min 0 – 0 1 - 1 0 - 1 0 - 0 0 - 0 0 - 1 0 - 0 1 - 1 1 - 1 0 - 0 0 – 1
10 min 0 – 0 2 - 2 1 - 2 0 - 0 0 - 0 0 - 1 0 - 0 2 - 2 2 - 2 0 - 0 0 – 1
9027 0 min 0 – 0 1 - 1 1 - 1 0 - 0 0 - 0 0 - 1 0 - 0 0 - 0 1 - 1 0 - 0 0 – 0
10 min 0 – 0 2 - 3 1 - 2 0 - 0 0 - 1 0 - 1 0 - 0 5 - 5 1 - 2 0 - 0 0 – 0
30 min 0 – 0 1 - 2 1 - 1 0 - 0 0 - 0 0 - 0 0 - 0 4 - 5 4 - 5 0 - 0 0 – 1
9205 0 min 0 – 0 1 - 1 1 - 1 0 - 0 0 - 0 0 - 1 0 - 0 2 - 2 2 - 2 0 - 0 0 – 1
10 min 0 – 0 2 - 2 1 - 2 0 - 0 0 - 0 1 - 2 0 - 0 2 - 2 1 - 2 0 - 0 1 – 2
9212 0 min 0 – 0 0 - 1 0 - 1 0 - 0 0 - 0 0 - 1 0 - 0 0 - 0 0 - 1 0 - 0 0 – 0
10 min 1 – 1 1 - 1 1 - 1 0 - 0 0 - 1 0 - 2 0 - 0 5 - 5 5 - 5 0 - 0 1 – 2
30 min 0 – 1 1 - 1 1 - 1 0 - 1 0 - 2 0 - 2 0 - 0 5 - 5 5 - 5 0 - 0 1 – 2
9218 0 min 0 – 0 1 - 1 1 - 1 0 - 0 0 - 0 0 - 1 0 - 0 1 - 1 1 - 1 0 - 0 0 – 0
10 min 0 – 1 2 - 3 1 - 2 0 - 0 1 - 1 0 - 1 0 - 0 2 - 3 2 - 3 0 - 1 1 – 1
30 min 0 – 0 1 - 1 1 - 1 0 - 0 0 - 1 0 - 1 0 - 0 2 - 3 2 - 3 0 - 0 0 – 0
60 min 0 – 1 2 - 3 1 - 2 0 - 0 0 - 2 0 - 2 0 - 0 3 - 4 3 - 4 0 - 0 0 – 1
TABLA 7. Caracterización enzimática de aislamientos patogénicos de Beauveria bassiana resistentes a diferentes tiempos de
exposición a la luz ultravioleta, por el sistema comercial Api-zym, en el sustrato Saboureaud- dextrosa-agar. Lectura
a los 30 min y 16 h de reacción.
Aislam. Enzima Fosfa Lipasas Proteasas Fosfatasas Galact Gluco Gluco
Fosfa Este Este Lipa Leuci Valina Fosf Na.-A- beta beta N-ac-
Tiempo Alcal C1 Lip C14 arilam arilam acid S-Bl-. galac gluco gluc
9002 0 min 0 – 0 0 - 1 0 - 1 0 - 0 0 - 1 0 - 1 0 - 1 0 – 1 0 - 0 0 - 1 0 - 0
10 min 0 – 0 1 - 2 0 - 1 0 - 0 0 - 1 0 - 1 0 - 1 1 – 1 0 - 0 0 - 0 0 - 1
30 min 0 – 0 0 - 1 0 - 1 0 - 0 0 - 1 0 - 1 0 - 1 1 – 2 0 - 0 0 - 0 0 - 0
60 min 0 – 0 1 - 3 0 - 2 0 - 1 0 - 2 0 - 1 5 - 5 5 – 5 1 - 2 1 - 1 0 - 1
9012 0 min 0 – 0 0 - 1 0 - 1 0 - 0 0 - 0 0 - 1 0 - 1 1 – 1 0 - 0 0 - 1 0 - 0
10 min 0 – 0 0 - 0 0 - 1 0 - 0 0 - 0 1 - 1 1- 1 1 – 2 0 - 0 1 - 2 0 - 0
9021 0 min 0 – 0 1 - 1 0 - 1 0 - 0 0 - 0 0 - 1 1 - 1 1 – 1 0 - 0 0 - 1 0 - 0
10 min 0 – 0 1 - 1 1 - 1 0 - 0 0 - 0 0 - 1 2 - 2 2 – 2 0 - 0 1 - 2 0 - 0
9027 0 min 0 – 0 1 - 1 1 - 1 0 - 0 0 - 0 0 - 1 0 - 0 1 – 1 0 - 0 0 - 0 0 - 0
10 min 0 – 0 0 - 0 1 - 1 0 - 0 0 - 1 0 - 1 2 - 3 1 – 1 0 - 1 0 - 0 0 - 0
30 min 0 – 0 1 - 1 1 - 1 0 - 0 0 - 1 0 - 1 4 - 5 2 – 3 0 - 1 0 - 0 0 - 0
9205 0 min 0 – 0 1 - 1 1 - 1 0 - 0 0 - 0 0 - 1 2 - 2 2 – 2 0 - 0 0 - 1 0 - 0
10 min 0 – 0 1 - 1 1 - 1 0 - 0 0 - 0 0 - 1 1 - 2 1 – 2 0 - 0 0 - 1 0 - 0
9212 0 min 0 – 0 0 - 1 0 - 1 0 - 0 0 - 0 0 - 1 0 - 0 0 – 1 0 - 0 0 - 0 0 - 0
10 min 1 – 1 2 - 2 1 - 1 0 - 0 0 - 1 0 - 1 1 - 1 0 – 0 0 - 0 1 - 1 2 - 2
30 min 1 – 1 1 - 2 1 - 1 0 - 0 0 - 1 0 - 0 0 - 1 1 – 1 0 - 0 2 - 2 2 - 2
9218 0 min 0 – 0 1 - 1 1 - 1 0 - 0 0 - 1 0 - 1 1 - 1 1 – 1 0 - 0 0 - 0 0 - 0
10 min 0 – 0 1 - 1 1 - 1 1 - 1 1 - 1 0 - 1 2 - 3 1 – 2 0 - 0 1 – 1 0 - 0
30 min 0 – 0 1 - 2 1 - 2 0 - 1 0 - 1 0 - 1 2 - 3 1 – 1 0 - 0 0 – 0 0 - 0
60 min 0 – 0 2 - 3 1 - 2 0 - 1 0 - 1 0 - 1 2 - 3 1 – 2 0 - 0 0 – 0 0 - 0
336 Cenicafé, 50(4): 327-337. 1999
Figura 2. Actividad enzimática
de un aislamiento del hongo
Beauveria bassiana sometido a la
luz ultravioleta durante diferentes
tiempos de exposición.
Figura 3. Actividad
enzimática de un aislamiento
del hongo Metarhizium
anisopliae sometido a la luz
ultravioleta durante
diferentes tiempos de
exposición.
Los aislamientos seleccionados en cuanto a
su tolerancia al efecto de la luz ultravioleta,
presentaron a su vez una mayor actividad
enzimática; sin embargo, se observó en éstos
una tendencia a la reducción de la viabilidad y
patogenicidad sobre la broca del café. Es posible
que mediante pases sucesivos de estos aislamientos
a través de la broca se puedan potenciar
nuevamente éstas últimas características, conservando
su resistencia a la luz ultravioleta, con
lo cual podrían formularse para ser evaluados
en campo, en el control de la broca, tal como lo
recomiendan Moore y Prior (8), quienes afirman
que la utilización de un agente biológico en
el campo debe obedecer a procesos de selección
previos en laboratorio, en los cuales se estudien
características relevantes para la aplicación y
uso eficiente en el campo.
Cenicafé, 50(4): 327-337. 1999 337
AGRADECIMIENTOS
TABLA 8. Porcentaje de patogenicidad a H. hampei de aislamientos de Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae
seleccionados por resistencia a la luz ultravioleta durante diferentes tiempos de exposición (Bioensayo en
laboratorio).
PORCENTAJE DE PATOGENICIDAD (%)
AISLAMIENTO TIEMPO DE EXPOSICIÓN A LA LUZ ULTRAVIOLETA
0 min 10 min 30 min 60 min
Bb 9002 83,3 47.5 47,5 42,5
Bb 9027 90,0 35 42,5 0
Bb 9212 86,7 50 52,5 0
Bb 9218 81,7 42,5 35,5 55
Ma 9303 92,5 59,4 57,5 60
LITERATURA CITADA
4. DECAZY, B. Descripción, biología, ecología y control
de la broca del café Hypothenemus hampei (Ferr.) In: 50
años de Cenicafé 1938-1988; Conferencias
conmemorativas. Chinchiná, Cenicafé, 1990. p. 133-
139.
5. DE DUVE, C. La célula viva. Barcelona, Prensa Científica,
1988. p 331-422.
6. GONZÁLEZ G,. M.T.; POSADA F., F.J.; BUSTILLO
P., A.E. Desarrollo de un bioensayo para evaluar la
patogenicidad de Beauveria bassiana sobre
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7. IGNOFFO, C.M.; BATZER, O.F. Microencapsulation
and ultraviolet protectans to increase sunlight stability of
an insect virus. Journal of Economic Entomology 64(4):
850-853. 1971.
8. MOORE, D.; PRIOR, C. The potential of
mycoinsecticides. Biocontrol News and information 14
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9. VALDÉS D., B. E. Utilización de fuentes de carbono y
nitrógeno y evaluación enzimática de aislamientos de
Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin, patogénicos
a la broca del café y con patogenicidad menor del 80%.
Manizales, Universidad Católica. Facultad de
Bacteriología, 1996. p 31-33. (Tesis: Bacterióloga).
10. VÉLEZ A., P.E.; MONTOYA R., E.C. Supervivencia
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condiciones de laboratorio y campo. Cenicafé 44 (3):
111-122. 1993
11. VILAS BOAS, A.M.; PACCOLA-MEIRELLES, L.D.;
LUNA-ALVES-LIMA, E.A. Desenvolvimiento e
aperfeicoamento de inseticidas biologicos para o controle
de pragas. Arquivos de Biologia e Tecnologia 35 (4):
749-761. 1992.
La realización de este estudio fue posible
gracias al soporte financiero brindado por
Colciencias y Cenicafé, dentro del marco del
proyecto “Caracterización y obtención de
cepas mejoradas de hongos entomopatógenos
para el control de la broca del café”. Los
autores expresan su agradecimiento al personal
de la disciplina de Entomología, al auxiliar
Silvio Marín y a los profesionales Alex
E. Bustillo, Martha E. Londoño Z. y Alba
Marina Cotes Prado.
1. BUSTILLO P., A.E. El hongo Beauveria bassiana como
un componente en un programa de manejo integrado de la
broca del café Hypothenemus hampei. In: Congreso de la
Sociedad Colombiana de Entomología-SOCOLEN, 22.
Santafé de Bogotá, julio 26-28 de 1995. Memorias.
Santafé de Bogotá, SOCOLEN, 1995. p. 79-83.
2. CALDWELL, M.M. Plant response to solar ultraviolet
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Ziegler, H. (eds.). Physiological plant ecology, I. Responses
to the physical environment. Berlín, Spowger-Verlag,
1981. p. 169-197. (Enciclopedia of plants physiology.
Vol 12 A).
3. DARNELL, J.; LODISH, H.; BALTIMORE, D. Biología
celular y molecular. Barcelona, Editorial Labor. 1988. p.
1067-1069.

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