Las moléculas y el estudio de los insectos

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LAS MOLÉCULAS, UNA ALTERNATIVA REAL PARA ESTUDIAR LOS INSECTOS

  • Publicado en: Memorias Sociedad Colombiana de Entomología (Socolen) XXVIII Congreso, Pereira, Colombia, agosto 8 - 10, 2001.


Sandra Uribe Soto, Ing. Agr., Ph. D.
Profesora Universidad Nacional de Colombia sede Medellín.
e-mail: suribe@perseus.unalmed.edu.co



INTRODUCCIÓN

Los insectos constituyen sin duda organismos de gran relevancia, las características propias de su existencia, su éxito biológico y ecológico como grupo y las diversas relaciones establecidas con el hombre, son apenas ejemplos de ello. El campo de la biología molecular y celular se ha expandido enormemente en los últimos años y muchos entomólogos han empezado a apropiarse de tecnologías que proveen un nivel nuevo de resolución para el estudio de sistemas ecológicos y taxonomía. Como sucede con otras tecnologías, una gran hipérbole ha rodeado el desarrollo e implementación de la biología molecular y celular en el caso de los insectos parte del optimismo, pero también de las controversias generadas alrededor de su utilización, son ciertamente justificadas.

El panorama de las alternativas y herramientas para estudiar los insectos en aspectos básicos y aplicados ha cambiado dramáticamente en los últimos 12 años. (Lycett 1990, Crampton 1991, Marjorie 1994, Smith et al., 1998). Aunque muchas de las aplicaciones se derivan de las tecnologías de ADN recombinante y genética molecular, es preciso señalar que estas constituyen solo una de las alternativas para estudiar, entender y trabajar los insectos (Parker et al., 1998). En esencia, estas nos permiten conocer, entender y manipular pero también complementar, analizar, aclarar, profundizar y validar hipótesis (Avise 1993,Futuyma 1998).

Como es bien sabido por todas las personas que se dedican a la entomología, uno de los insectos ampliamente estudiado en términos de biología molecular es Drosophila melanogaster. (Quicke 1993, Marjorie 1994,Simond et al., 1994, Loxdale y Lushai 1998). Aunque inicialmente las personas que se dedicaron a realizar dichos estudios no tenían intereses en áreas entomológicas sino en fisiología y salud humana, en los últimos años ha habido un interés creciente por utilizar otros insectos como modelo para estudiar procesos con aplicaciones particulares a problemas entomológicos (Ashburner 1989). Muchas de las técnicas moleculares, han afectado significativamente nuestro conocimiento sobre los insectos con las implicaciones que de ello se derivan y en el futuro tendrán sin duda un gran impacto en la entomología (Avise 1993, Marjorie 1994, Loxdale y Lushai 1998, Futuyma 1998)

El estudio de la biología celular y molecular constituye un tributo a la curiosidad humana en su aspiración de realizar descubrimientos y a su inteligencia creativa para diseñar los instrumentos complejos y las elaboradas técnicas mediante las que se pueden efectuar esos descubrimientos. Esto no significa que los biólogos celulares y moleculares sean los únicos dotados con estos rasgos. En un extremo del espectro científico, los astrónomos estudian objetos en las orillas más alejadas del universo con propiedades muy diferentes a las que se encuentran sobre la tierra y en el otro lado del espectro, están los físicos nucleares que dirigen su atención sobre partículas de dimensiones subatómicas las cuales poseen igualmente propiedades inconcebibles. Por lo tanto, es muy claro que nuestro universo contiene mundos dentro de otros mundos y el estudio de todos sus aspectos es fascinante. En tal sentido, la finalidad de esta charla es generar entre las personas que están escuchando, un interés por las células y las moléculas en relación con los insectos, ese grupo de organismos que tanto nos apasionan y que nos reúnen anualmente en el congreso de entomología.

LAS CÉLULAS, LAS MOLÉCULAS Y LOS ORGANISMOS

A mediados del siglo XVII un puñado de científicos pioneros había utilizado sus microscopios caseros para descubrir un mundo que nunca se había revelado al ojo humano desnudo, -la célula. Este descubrimiento se le atribuye a Robert Hoocke un microscopista inglés premiado con el puesto de guardián de la Royal Society, la academia científica más antigua de Inglaterra (Watson et al., 1987).

Trabajos importantes en el área del conocimiento de la célula incluyen el de Anton Van Leewenhock quien durante 50 años estuvo describiendo sus observaciones microscópicas; sin embargo, no fue sino hasta el decenio de 1830 que se comprobó la gran importancia de las células y en 1838 Matías Schleiden, abogado alemán convertido en botánico, concluyó que a pesar de las diferencias en la estructura de diversas plantas, éstas estaban constituidas de células y que el embrión de una planta tuvo su origen en una sola célula (Futuyma 1998).

Numerosos estudios sobre las propiedades básicas de la célula, su complejidad y elevada organización así como el descubrimiento de su programa genético y los recursos para afectarlo, generaron innumerables cambios que permitieron acercarse a los organismos, estudiarlos y entenderlos mucho mejor (Quicke 1993).

Años después, el descubrimiento de la estructura de la molécula del ADN resultó en una explosión de investigación de la biología molecular y genética que, pavimentó la vía para la revolución de la biotecnología, una biotecnología en la cual se incluyó el estudio de los insectos (Watson et al., 1987, Quicke 1993, Marjorie 1994).

El conocimiento sobre la organización celular, constituye un pequeño avance posterior al descubrimiento del nivel atómico. Esto puede observarse al examinar la importancia de los movimientos de algunos átomos de las moléculas durante actividades como la contracción muscular o el transporte de sustancias a través de membranas celulares. Las actividades de la célula y sus organelos se derivan directamente de la actividad de las moléculas que las constituyen, por lo tanto, para entender las actividades que tienen lugar dentro de una célula, es necesario conocer algo sobre las interacciones ente el ADN y moléculas de proteínas, cuyo resultado es la condensación de los cromosomas en paquetes con forma de bastoncillos que se separan en células diferentes mediante el proceso de división celular (Marjorie 1994).

Si nos remitimos a las bases químicas y moleculares de la vida, incluida la de los insectos, debemos recordar que ésta se centra en la química del átomo de carbono (C). La cualidad esencial de este átomo que le permite desempeñar papeles muy importantes es el increíble número de moléculas que puede formar. El átomo de carbono posee 4 electrones en su capa externa y por lo tanto, puede enlazarse a otros 4 átomos; además, cada átomo de C puede formar enlaces con otros átomos de carbono y de esta manera construir moléculas con esqueletos que contienen largas cadenas de átomos. Los esqueletos de carbono pueden ser lineales, ramificados o cíclicos. Tanto el tamaño como la estructura electrónica del carbono, le confieren características particularmente adecuadas para generar numerosas moléculas, de las cuales se conocen varios cientos de miles (Post et al., 1991, Marjorie 1994).

Las moléculas para estudiar y entender los organismos y por ende los insectos se clasifican de acuerdo a su función biológica. Las moléculas orgánicas comúnmente observadas dentro de la célula incluyen varias categorías según su papel en el metabolismo, así:

En el primer grupo encontramos las macromoléculas: moléculas que forman la estructura y ejecutan las actividades de las células. Son grandes y altamente organizadas y en todos los casos contienen docenas de millones de átomos de carbono. Debido a su tamaño y a las intrincadas formas que las macromoléculas pueden adoptar, algunas de estas gigantescas moléculas pueden ejecutar tareas complejas con gran precisión y eficiencia. La presencia de macromoléculas más que cualquier otra característica, le confiere a los organismos, en nuestro caso particular a los insectos, las propiedades de la vida y las singulariza químicamente dentro del mundo inanimado (Marjorie 1994, Futuyma, 1998)

Las macromoléculas podemos dividirlas en proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos y lípidos. Los tres primeros, son polímeros compuestos de gran número de elementos de bajo peso molecular llamados monómeros. La estructura básica y función de cada familia de macromoléculas es muy similar en todos los organismos desde las bacterias, hasta los insectos y los seres humanos. Es necesario observar con atención las secuencias específicas de los monómeros que constituyen las diferentes macromoléculas para apreciar la diversidad entre los organismos (Marjorie 1994).

En el segundo grupo de moléculas encontramos aquellas que conforman un almacén de precursores de bajo peso molecular que están listos para incorporarse a las macromoléculas. Dentro de una célula la mayor parte de estas moléculas tienen un período de vida breve en comparación con la misma célula. Entre ellas están: los azúcares como precursores de polisacáridos, los aminoácidos como precursores de proteínas, los nucleótidos como precursores de ácidos nucleicos y los ácidos grasos que se incorporan a lípidos.

En el tercer grupo aparecen los intermediarios metabólicos, que poseen una estructura química compleja y deben sintetizarse paso a paso en secuencias iniciadas con materias primas específicas. Cada serie de reacciones químicas dentro de la célula se conoce como una vía metabólica, los compuestos formados a lo largo de las vías metabólicas pueden generar productos que no tienen por si mismos una función y a los cuales se les denomina intermediarios metabólicos.

En el cuarto grupo aparecen moléculas con diferentes funciones. Aquí se incluye una categoría muy amplia de moléculas. Gran parte de la masa del peso seco de una célula está formado por macromoléculas y sus precursores directos. Las moléculas de función diversa incluyen sustancias como vitaminas (cuya función principal es actuar como coadyuvantes), ciertas hormonas y esteroides, moléculas que participan en el almacenamiento de energía como ATP, moléculas reguladoras como AMP cíclico y productos de desecho metabólico como la urea (Post et al., 1991, Marjorie 1994, Futuyma, 1998).

Las moléculas utilizadas para estudiar los organismos y por ende los insectos se refieren generalmente así:

1. Carbohidratos: Son un grupo de sustancias que incluyen azúcares simples o monosacáridos y todas las moléculas más grandes construidas con bloques de azúcares. La principal función es almacenar energía química y como material de construcción durable para estructuras biológicas. En el caso particular de los insectos vale la pena mencionar la quitina, polímero no ramificado de azúcar n-acetil-glucosamina similar en estructura a la glucosa pero que tiene un grupo acetilamina en vez de un grupo hidróxilo enlazado al segundo átomo del anillo.

2. La quitina es un material estructural ampliamente distribuido entre los invertebrados particularmente en la cubierta externa de los insectos aunque también se encuentran en arañas y crustáceos. Es correosa, resistente pero flexible, no muy diferente a ciertos plásticos. Los insectos tienen gran éxito debido a este polisacárido altamente adaptable que los protege de agentes externos (Crampton 1991,. Quicke 1993, Marjorie 1994)

3. Lípidos: Son un grupo de moléculas biológicas diversas no polares cuya única propiedad común es la capacidad para disolverse en solventes orgánicos como cloroformo y benceno y su incapacidad para disolverse en agua, propiedad que explica muchas de sus variadas funciones biológicas. Los lípidos importantes en las funciones celulares incluyen grasas, esteroides y fosfolípidos. Aunque ninguna de estas moléculas es lo bastante grandes como para llamarse macromoléculas con frecuencia se agregan como las gotas de grasa o en las membranas para formar complejos suficientemente grandes que pueden verse en el microscopio de luz. Al respecto y para el caso particular de los insectos, sobra resaltar la importancia del cuerpo graso para su desarrollo y funcionamiento (Quicke 1993, Marjorie 1994).

4. Proteínas: Son las macromoléculas que ejecutan prácticamente todas las actividades de la célula. Existen en diversas disposiciones y cumplen variadas funciones como por ejemplo las enzimas. También actúan como fibras estructurales que suministran apoyo en el perímetro exterior de las células. Las proteínas ejecutan una gran variedad de funciones reguladoras como transportadores y receptores de la membrana. Como elementos contráctiles, las proteínas constituyen el mecanismo biológico del movimiento, entre sus muchas y diversas funciones, estas actúan como anticuerpos, es decir, tienen gran influencia en los mecanismos de respuesta inmune ya que sirven como toxinas, forman coágulos, absorben o refractan la luz y transportan sustancias de una parte del cuerpo a otra. Como veremos más adelante estas han sido una de las moléculas más estudiadas y con amplias aplicaciones en lo relacionado con la fisiología de los insectos. Igualmente, han sido de gran utilidad como caracteres moleculares en sistemática. (Quicke 1993, Simond et al., 1994, Marjorie 1994 Futuyma, 1998)

5. Ácidos Nucleicos: Los ácidos nucleicos son macromoléculas constituidas en forma de cadena larga o hebra de monómeros llamados nucleótidos. La función principal de los ácidos nucleicos es almacenar y transmitir información genética, pero también pueden desempeñar funciones estructurales o catalíticas. Hay dos tipos de ácidos nucleicos en los organismos vivos: ácido ribonucleico ARN y el ácido desoxirribonucleico ADN. El ADN es el material genético de todos los organismos celulares. En las células la información almacenada en la plantilla del ADN se emplea para dirigir las actividades celulares durante la formación del ARN mensajero. En una cadena de ADN o ARN cada nucleótido consta de tres partes: un azúcar, un grupo fosfato y una base nitrogenada. Estas se llaman así porque en los anillos de sus moléculas se encuentran átomos de Nitrógeno. El fosfato está unido al carbono 5´ del azúcar y la base nitrogenada se pega al carbono 1´ de los azúcares. Durante el ensamblado de una cadena de ácido nucleico el grupo hidroxilo, fijado al carbono 3 del azúcar de un nucleótido queda unido mediante una unión ester- al grupo fosfato unido al carbono 5´ del siguiente nucleótido de la cadena; así los nucleótidos de una cadena de ARN o ADN están conectados por enlaces azúcar–fosfato que se describen como enlaces 3´- 5´fosfodiester. Una cadena de ARN o ADN contiene cuatro tipos diferentes de nucleótidos que se distinguen por su base nitrogenada. Dos tipos de bases se encuentran en los ácidos nucleicos pirimidinas y purinas. Las pirimidinas son moléculas más pequeñas que constan de un solo anillo y las purinas son más grandes y poseen dos anillos. El ARN contiene dos purinas: Adenina y Guanina; y dos pirimidinas: Citosina y Uracilo; pero en el ADN se sustituye el Uracilo por la Timina, una pirimidina con un grupo metilo extra pegada al anillo (Watson et al., 1987,Quicke 1993, Marjorie 1994).

ORGANIZACIÓN GENETICA Y MOLECULAR EN INSECTOS

Los genes de los insectos también están organizados en cromosomas que aparecen como estructuras complejas. Estos a su vez están formados por proteínas, ARN y ADN. Como en otros organismos la información biológica es llevada en el ADN, transferida primero a ARN y después a proteínas (Quicke 1993, Marjorie 1994).
Diferentes especies de insectos tienen diferente número de cromosomas haploides que varía entre 1 y 22. Drosophila melanogaster tiene aproximadamente 165.000 kilo bases de ADN localizado en cuatro cromosomas. El tamaño promedio de un gen es de aproximadamente 5 kb y Drosophila tiene aproximadamente 20.000 genes. En la mayoría de los insectos hay dos copias de cada cromosoma en las células somáticas y en los huevos y espermatozoide existe un complemento haploide (Ashburner 1989).

El tamaño del genoma varía ampliamente entre especies de insectos. Por ejemplo en el género Tribolium (Coleoptera), el genoma puede variar entre 0.157 a 0.388 picogramos (pg) de ADN. La cantidad de ADN en las células es un poco difícil de medir porque muchos tejidos son poliploides con diferentes tejidos exhibiendo diferentes grados de ploidia. Por ejemplo, Bombyx mori tiene 1 pg de ADN por hemocito, pero las células poliploides de las glándulas de seda contienen 170.000 pg de ADN por núcleo. El contenido de ADN en las células de insectos también puede variar con el estado de desarrollo. En Bombix mori; la cantidad de ADN disminuye aproximadamente 81% después de que los adultos emergen de la pupa, lo cual es probablemente debido a la histólisis de las glándulas “de seda“ en la larva (Quicke 1993, Simond et al., 1994, Marjorie 1994).

El ADN que no codifica puede constituir entre el 30 y el 90% del genoma de un insecto y existen numerosas teorías que tratan de explicar la persistencia de tal genoma llamado comúnmente parásito. Las proporciones de bases nitrogenadas en el genoma de insectos son menores que aquellas encontradas en vertebrados así, Guanina + Citosina comprende entre el 32 a 42% (45% en vertebrados). En cuanto al ADN mitocondrial también se han encontrado diferencias, especialmente altos contenidos de Adenina + Timina. Con los valores más altos encontrados en abejas (Quicke 1993).

En insectos se han identificado secuencias de ADN móviles entre los cromosomas llamadas transposones. Estos elementos constituyen una proporción significativa del componente del genoma en insectos. Los insectos al igual que otros organismos además contienen un ADN extranuclear en las mitocondrias (Quicke 1993, Simond et al., 1994, Marjorie 1994).

También existen cromosomas llamados cromosomas B, conocidos como cromosomas supernumerarios encontrados en algunos otros animales y plantas. Al parecer están relacionados con el fenotipo de los organismos y ocurren solo en algunos individuos. Estos son comunes en muchas especies de Orthoptera. Adicionalmente, se han encontrado mini cromosomas en insectos como Drosophila melanogaster derivados aparentemente de elementos transposones. Algunos de estos contienen dos genes estructurales y se ha encontrado que son estables y heredables. También se ha observado ADN circular y ADN satélite (Quicke 1993, Marjorie 1994).

POR QUE LAS TÉCNICAS MOLECULARES HAN SIDO ULTILIZADAS RELATIVAMENTE POCO POR LOS ENTOMÓLOGOS?

Las técnicas de ADN recombinante y de biología molecular han sido realizadas normalmente por personas entrenadas y capacitadas en bioquímica y hasta hace poco, muchos entomólogos consideraban la mayoría de dichas técnicas complejas y difíciles. Por esta razón, los entomólogos tardaron en acceder ellos mismos a estudios de poblaciones o biología de insectos con base en moléculas. Debido a esto, la mayoría de la literatura publicada estaba enfocada fundamentalmente en los trabajos con Drosophila melanogaster con énfasis en la estructura de los genes, regulación y evolución humana (Post et al., 1991, Avise 1996)

Para Drosophila existe un conocimiento extensivo que va desde el mapa físico hasta la secuencia completa de numerosos genes. En contraste, para otros insectos la información con aplicación directa a problemas entomológicos es escasa y reciente. Los análisis de las moléculas en insectos son importantes para la resolución de problemas básicos y aplicados. Drosophila puede ser un insecto altamente especializado con características genéticas muy particulares. Los insectos transmisores de enfermedades constituyen un importante grupo para el cual existen mapas genéticos. Así mismo, se ha implementado el estudio de genomas de insectos importantes en la agricultura como Ceratitis capitata, Bombix mori, Tribolium castaneum entre otros (Post et al., 1991, Quicke 1993, Avise 1996).

TÉCNICAS UTILIZADAS: PRINCIPIOS Y APLICACIONES EN INSECTOS

Los métodos potenciales para estudiar las células de los insectos, analizar sus proteínas, ADN nuclear y mitocondrial incluyen entre otros: cultivos celulares, electroforésis, citogenética, clonación, enzimas de restricción, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y sus derivados, hibridación de ADN, obtención de secuencias, “Fingerprinting” y transformación genética. La implementación de cada método requiere variaciones en cuanto al tiempo, el costo, la dificultad para su ejecución y el nivel de variabilidad detectable (Avise 1999, Quicke 1993, Futuyma 1998) .

ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS

Esta técnica hace referencia a la separación de proteínas que migran bajo la influencia de un campo eléctrico cuando se encuentran en medio acuoso y sobre un soporte poroso. La migración ocurre de acuerdo a características como la carga y el peso molecular de la proteína. Los métodos principales de electroforésis de proteínas difieren por la naturaleza del medio de soporte o gel usado; poliacrilamida (polímeros de acrilamida-bisacrilamida), agarosa, almidón y acetato de celulosa. Futuyma 1998,. Simond et al., 1994)

A partir del origen de la electroforésis y la visualización histoquímica de las enzimas en geles, ha ocurrido una revolución en el conocimiento de los procesos y niveles macro y micro evolutivos en insectos como en otros organismos.

Las isoenzimas y alozimas son proteínas codificadas por genes nucleares con funciones fisiológicas reconocidas. Los cambios en su movilidad permiten establecer diferencias bioquímicas entre organismos. Su utilización en insectos se enmarca fundamentalmente en el área de la sistemática incluyendo aspectos relativos taxonomía, filogenética, evolución, ecología y genética de poblaciones. Mediante la aplicación de esta técnica se ha incrementado el conocimiento respecto a distribuciones geográficas de las frecuencias alélicas, eventos históricos de dispersión, flujo genético y límites entre especies de insectos (Simond et al., 1994).

Los alelos separados electroforéticamente se analizan midiendo la distancia de migración de las enzimas visualizadas como bandas; con base en esto se calculan las frecuencias alélicas y se utilizan estimativos y parámetros propios de la genética de poblaciones. Los análisis incluyen porcentaje de polimorfismo bioquímico, heterozigosidad por locus y desviaciones de los genotipos con relación a los valores esperados cuando las poblaciones están en equilibrio (Hardy-Weinberg). Adicionalmente, se emplean análisis estadísticos conocidos como Fst referentes a la varianza estandarizada de las frecuencias alélicas. Otras medidas incluyen coeficientes de identidad o distancia genética como las de Roger (D) y Nei (N). A partir de estas medidas pueden construirse también árboles filogenéticos (Avise 1991, 1996, Simond et al., 1994).

Algunas dificultades en el trabajo con isoenzimas incluyen la necesidad de tejidos de insectos frescos o criopreservados por la labilidad de las enzimas, el enmascaramiento potencial de algunos cambios nucleotídicos y la presencia de electromorfos atípicos. Sin embargo, esta es una de las técnicas más eficientes en términos de costo-beneficio y permite utilizar un gran número de insectos al mismo tiempo. Adicionalmente, en algunos grupos de insectos se ha encontrado que no existe una variabilidad adecuada detectable por este método (Quicke 1993, Simond et al., 1994).

Ejemplos de la utilización de la electroforésis de proteínas en insectos incluyen:-1) la identificación de Japón como el sitio de origen de las poblaciones del mosquito Aedes albopictus que colonizó Brasil y Estados unidos; 2) la identificación de especies de Bemisia tabaci; 3) el monitoreo de los enemigos naturales del género Coccinella y 4) la identificación de sondas taxonómicas para insectos como Ceratitis capitata (Quicke 1993, Simond et al., 1994, Parker et al., 1998.)

CROMOSOMAS: CITOGENÉTICA MOLECULAR

Estas técnicas permiten fundamentalmente el análisis de los aspectos microscópicamente visibles de los cromosomas. La cariología o citogenética ha ocupado un lugar prominente en biología comparativa y estudios sistemáticos. Los datos citogenéticos proveen información filogenética independiente de datos morfológicos, bioquímicos y de comportamiento revelando diferencias o similitudes que pueden no ser obvias morfológicamente. Desde 1888 hasta ahora, se han incluido numerosas innovaciones tecnológicas ampliando sus aplicaciones y análisis. Los aspectos fundamentales utilizados en la actualidad son: -cromosomas: número y morfología: cariotipos, -técnicas de bandeo: identificación de cromosomas homólogos y homeólogos e -Hibridación in situ de sondas de ácidos nucleicos en preparaciones citológicas de cromosomas para localizar secuencias específicas de ADN en sitios específicos de los cromosomas (Quicke 1993, Simond et al., 1994, Parker et al., 1998).

El uso de inmunoquímica junto con hibridación in situ ha permitido desarrollar una técnica conocida como “pintado de cromosomas” basada en la detección de sondas hibridizadas con fluorocromos, esta técnica es conocida domo Hibridación Fluorescente In Situ FISH. Las sondas se marcan con anticuerpos monoclonales o policlonales fluorescentes. Utilizando FISH se ha detectado la amplificación de genes que confieren resistencia a insecticidas en afijos y otros insectos. Aunque es una técnica costosa posee un alto poder de resolución (Loxdale y Lushai, 1998, Parker et al., 1998).

Cromosomas politénicos: Estos cromosomas son somáticos y presentan varios ciclos de endo replicación, es decir, replicación de ADN sin división del núcleo. Consisten en cientos de miles de cromátidas sin separar y se encuentran en células de larvas de dipteros, colémbolos y otros invertebrados. Estos cromosomas son relativamente fáciles de preparar a partir de larvas de Diptera especialmente de las familias Drosophilidae, Chironomidae, Cecidomyiidae y Sciaridae. Normalmente las preparaciones se hacen a partir de glándulas salivales. Las glándulas pueden exponerse rápidamente removiendo la cabeza con unas pinzas así como el cuerpo graso. Posteriormente, las glándulas son aplastadas sobre una placa portaobjetos. Los cromosomas de ciertas especies son lo suficientemente grandes como para observar incluso configuraciones meióticas. Los cromosomas politénicos también ocurren en el intestino medio y cuerpo graso de insectos (Simond et al., 1994, Parker et al., 1998).

En estados particulares de desarrollo de muchos Diptera se observan “puffs” en los cromosomas politénicos; estos consisten en una abertura de una región de ADN en el cromosoma de aproximadamente una a 10 bases de longitud. Los patrones de aparición y desaparición de estas aberturas varían en diferentes estadios de desarrollo de los insectos, indicando que en cada uno de ellos se activan genes diferentes. Los “puffs” más grandes contienen genes que codifican para proteínas que son producidas en altas cantidades como las secreciones de glándulas salivares y seda (Marjorie 1994, Quicke 1993, Simond et al., 1994).

Telómeros: son los extremos de los cromosomas. Son difíciles de visualizar y tienen importantes funciones: Tienen como función prevenir los extremos pegajosos de los cromosomas para que no se fusionen entre ellos y asegurar que el cromosoma entero se replique durante la meiosis y mitosis. Los análisis moleculares señalan que los telómeros consisten de una serie de nucleótidos repetidos y proteínas que se unen de forma específica a estas secuencias. Se han realizado numerosos esfuerzos para clonar centrómeros y telómeros de insectos ya que esto ofrece la posibilidad de desarrollar cromosomas artificiales para insectos, como se ha realizado en levaduras. Se conoce que factores genéticos y fisiológicos afectan la longitud de los telómeros y dado que ésta disminuye con la edad, el trabajo sobre la pérdida de ADN en los extremos de los cromosomas o telómeros tiene un uso potencial para determinar la edad “exacta” de los insectos, lo cual es de suma importancia en la epidemiología de enfermedades transmitidas por insectos como malaria (Quicke 1993, Marjorie 1994 Loxdale y Lushai1998).

CLONACIÓN

Clonar significa introducir ADN exógeno en un organismo y multiplicarlo en sus células utilizando un agente vector. Los vectores son segmentos de ADN que contienen orígenes de replicación y pueden ser plásmidos, bacteriófagos, o estructuras híbridas llamadas cósmidos. Las bacteria Escherichia coli es usada frecuentemente para clonar ADN de insectos previamente introducido en plásmidos (Quicke 1993, Marjorie 1994)..

Los cultivos celulares de insectos especialmente de células epiteliales de intestino, también son utilizados para la clonación y expresión de Baculovirus como el virus de la poliedrosis nuclear de Bombix mori. La utilización de cultivos celulares representa enormes aplicaciones en la producción masiva de virus entomopatógenos y en la producción comercial de proteínas. Por ejemplo, proteínas de gran importancia para humanos como el interferón involucrado en los mecanismos de respuesta inmune, se han clonado y expresado en cultivos de células de Spodoptera frugiperda infectadas con el virus Autographa californica. (Crampton 1991, Marjorie 1994, Smith et al., 1998)

Con base en la clonación se han construido librerías genéticas de insectos y se ha realizado el mapeo de numerosos genes. También se han aislado y caracterizado genes de importancia en fisiología. Para clonar o amplificar el ADN es necesario extraerlo del insecto. El grado de pureza necesario depende de la pregunta biológica. Insectos conservados en etanol, isopropanol, secos y en nitrógeno líquido han mostrado ser útiles para extraer cantidades apreciables de ADN. Utilizando por ejemplo soluciones de extracción descritos comúnmente en la literatura en combinación con técnicas de macerado y centrifugación, es posible obtener entre 50 y 200 ng de ADN a partir de insectos de menos de 5 mm de longitud (Marjorie 1994, Simond et al., 1994).

AMPLIFICACIÓN DE ADN MEDIANTE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA PCR

El PCR es un método para amplificar in vitro pequeñas cantidades de ADN o ARN. Esta técnica puede usarse para aislar fragmentos o secuencias específicas. Existe una gran cantidad de modificaciones desarrolladas a partir de PCR que permiten aplicaciones adicionales (Marjorie 1994).

La amplificación in vitro de las moléculas mediante PCR se hace teniendo en cuenta las bases de duplicación de ADN que ocurre en los organismos y los elementos que en ella participan. Un ADN molde a ser replicado, pequeños oligonucleótidos que actúan como cebadores o “primers” y se adhieren por complementariedad a la cadena molde definiendo el comienzo y el final de la región a ser amplificada, nucleótidos que formarán las nuevas cadenas, una enzima que polimeriza, un buffer y cofactores que regulan la reacción, principalmente Mg. Adicionalmente, se proporcionan los cambios de temperatura que permiten la separación de la cadena doble de ADN molde, la unión de los oligonucleótidos y la actividad de la enzima. Estas reacciones se llevan a cabo en un termociclador o máquina de PCR. El poder de amplificación de la PCR es dramático. Teóricamente una sola molécula puede amplificarse para producir cualquier cantidad de copias; sin embargo, esta característica genera también enormes problemas de contaminación y hace necesaria una planeación cuidadosa de los experimentos y el uso de controles adecuados (Quicke 1993, Marjorie 1994, Simond et al., 1994).

Los productos amplificados son visualizados bajo luz ultravioleta utilizando como soporte geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio. Gracias a la PCR se ha hecho posible obtener información sobre la variación en el genoma entero de los insectos. La parte más difícil en su implementación la constituye el diseño adecuado de los cebadores (“primers”) que delimitan la región a amplificar; sin embargo, para insectos existen muchos cebadores universales y algunos investigadores han trabajado extensivamente en el diseño adecuado de estos fragmentos (Simond et al., 1994).

Mediante PCR se han amplificado y estudiado secuencias de ADN nucleares y mitocondriales de insectos incluidos especímenes fósiles o provenientes de museos. Una de las regiones mejor estudiadas en insectos y otros organismos utilizando PCR es la del ADN ribosomal nuclear. Esta región está formada por subunidades -genes- llamadas 28S, 5.5S y 18S. Estas regiones -que codifican- están acompañadas de espaciadores entre los genes llamados ITS1 e ITS2 localizados a cada lado del gen 5.5S. Estos módulos se repiten muchas veces y están unidos entre sí por regiones ínter- génicas IGS. Además del ADN ribosomal nuclear, pocos genes nucleares han sido utilizados para estudiar insectos en el área de la sistemática. Algunos incluyen el gen blanco de Drosophila melanogaster y otros que codifican para enzimas de gran importancia en fisiología como las vitelogeninas involucradas en el desarrollo coriónico de huevos y el de la seda en Bombix mori (Marjorie 1994).

En el caso de la utilización de genes o espaciadores ribosomales nucleares -ITS e IGS- debe tenerse especial consideración, ya que en algunos insectos se han encontrado patrones atípicos de evolución observándose una variabilidad igual o superior entre clones de un mismo individuo y entre individuos (Quicke 1993, Simond et al., 1994).

La PCR se ha utilizado exitosamente para distinguir, miembros de poblaciones o complejos de especies en plagas forestales y vectores de enfermedades y en estudios fisiológicos de Hymenoptera. También para detectar ADN exógeno en insectos transgénicos, una de las aplicaciones biotecnológicas en insectos que ha generado mayor controversia. (Quicke 1993, Simond et al., 1994).

Finalmente, mediante PCR es posible detectar e identificar microorganismos patógenos en insectos gracias a la existencia cebadores específicos para determinados patógenos que amplifican el ADN de estos organismos bajo condiciones de PCR previamente establecidas (Simond et al., 1994).

AMPLIFICACIÓN AL AZAR DE ADN POLIMÓRFICO RAPDS

Esta técnica consiste en crear perfiles de bandas de ADN amplificado al azar a partir del insecto de interés utilizando pequeños cebadores (aproximadamente 10 pares de bases). La secuencia escogida para el cebador que amplificará al azar ADN del insecto en cuestión es arbitraria. Sin embargo, dicha escogencia se realiza teniendo en cuenta la existencia de solo cuatro bases nitrogenadas: adenina, guanina, timina y citosina y la probabilidad de que por complementariedad estos pequeños fragmentos se unan a la secuencia molde en diversos lugares. La amplificación de ADN en el insecto mediante PCR ocurre solo donde los cebadores encuentran sitios complementarios separados por 3000pb. Las diferencias en los patrones de bandas amplificados son utilizadas para determinar la variabilidad (Marjorie 1994, Simond et al., 1994).

Estos marcadores muestran dominancia en los heterozigotes y existen muchos trabajos cuyos resultados no ha sido posible reproducir usando esta técnica. El RAPD-PCR aparece como una modificación que ha permitido redireccionar su utilización. En el RAPD-PCR se emplean pares de cebadores para amplificar bandas de ADN al azar, que luego son cortadas del gel y secuenciadas. El RAPD-PCR puede usarse para producir amplificados de secuencias de ADN características o SSCARs que permiten identificar con gran especificidad insectos o grupos de estos (Marjorie 1994, Simond et al.,1994,).

Los polimorfismos detectados por RAPD-PCR pueden así mismo visualizarse mediante polimorfismos conformacionales de cadena simple SSCPs, una técnica adicional que revela los cambios en las secuencias de ADN con base en la movilidad electroforética de las cadenas sencillas de ADN, también puede utilizarse electroforésis en geles con gradientes de desnaturalización DGGE (Simond et al., 1994).

La taxonomía de afijos y polillas, así como la detección de parasitoides en insectos plaga, constituyen ejemplos de la utilidad de estas técnicas. También se han realizado estudios de maternidad en abejas, determinación de la procedencia de esperma y mapeo de genes. El método de RAPDs es relativamente rápido, revela una importante variabilidad genética y existen numerosos cebadores para insectos producidos comercialmente. No obstante, posee algunas limitaciones relacionadas con la naturaleza dominante de los marcadores y la estandarización de la técnica en cuanto a la concentración inicial de ADN (Ehrlich 1984, Marjorie 1994, Simond et al., 1994, Pachamutu et al., 1998)

POLIMORFISMO EN LA LONGITUD DE FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN RFLPS

La variación en las secuencias del ADN de insectos puede examinarse indirectamente comparando por electroforésis fragmentos de ADN generados mediante cortes con enzimas de restricción. La variación observada en los fragmentos puede ocurrir en número, tamaño, o conformación. Esta es una técnica poderosa y efectiva en términos de costos, que permite analizar números relativamente grandes de individuos (Simond et al., 1994).

Los RFLPs detectan variaciones en el ADN de insectos cortándolo con enzimas de restricción. Estas enzimas fueron reconocidas en bacterias para inactivar virus y posteriormente fueron sintetizadas y utilizadas comercialmente. Dichas enzimas, reconocen secuencias específicas de ADN y las cortan cuando las encuentran. Los cambios en la longitud de los fragmentos resultantes de la restricción del ADN de los insectos tratado con estas enzimas, corresponden a diferencias existentes en las secuencias de nucleótidos entre los mismos (Marjorie 1994, Simond et al., 1994).

En esta técnica se utilizan una o más enzimas de restricción que reconocen secuencias de cuatro a seis bases de longitud. Los fragmentos pueden ser visualizados bajo luz ultravioleta en geles de agarosa utilizando bromuro de etidio o con mayor resolución en geles de poliacrilamida.

Para incrementar la resolución y detectar una mayor variabilidad también se han creado sondas marcadas con radioactividad o fluorescencia a partir de librerías genómicas. De forma sencilla, las sondas se producen cortando el ADN genómico del insecto de interés con una o más endonucleasas que reconocen muchos sitios. Los fragmentos resultantes son insertados en plásmidos o cósmidos que son subsecuentemente clonados en bacterias. El ADN clonado se encuentra e identifica con base en secuencias homólogas de otros organismos y se utiliza como una sonda después de ser purificado. Una vez que se producen las sondas de ADN para las especies en cuestión, estas se digieren y se corren en un gel (Simond et al., 1994).

El ADN puede transferirse de forma permanente a membranas de “nylon” usando una técnica conocida como “Southern blot”. La sonda es hibridizada a la membrana y el exceso de ADN es lavado. Posteriormente, la membrana se observa y analiza por auto radiografía. (Marjorie 1994)

Existe también una modificación de la técnica de RFLPS conocida como PCR- RFLPs, ésta ha solucionado algunas de las desventajas de la técnica tradicional. En ella, la reacción en cadena de la polimerasa PCR, se utiliza para amplificar partes específicas de ADN cuyos cebadores se obtienen de la siguiente forma: clones bacteriales con insertos del ADN del insecto en cuestión entre 500 a 2000 pares de bases se seleccionan de las bacterias, se obtienen las secuencias de nucleótidos de sus extremos y se construyen los cebadores. Posteriormente, se realizan las amplificaciones y el ADN es digerido con las enzimas de restricción. Una de las ventajas de esta modificación es que el ADN extraído de un solo individuo es suficiente después del PCR para proveer numerosas bandas que pueden ser visualizadas sin realizar hibridación. Esto facilita el estudio de especímenes de insectos muy pequeños de forma rápida y a menor costo. Biotipos de muchos insectos como afijos, moscas de las frutas y parasitoides Hymenoptera se han identificado por este método. De igual forma, se ha realizado detección de endosimbiontes bacteriales en insectos y estudio de efectos fundadores y cuellos de botella en poblaciones (Simond et al., 1994) .

En virtud de la habilidad de los RFLPs para detectar ADN en ambos miembros de cada par de cromosomas homólogos, la información proporcionada con esta técnica se considera como un marcador con herencia mendeliana codominante con un gran poder de resolución (Marjorie 1994).

El ADN mitocondrial de insectos ha sido sujeto particular de estudios con RFLPs . Este ADN es una herramienta poderosa para estudios evolutivos, de biogeografía y para establecer relaciones filogenéticas. La carencia de recombinación del ADN mitocondrial puede producir estimativos de diversidad genética con errores estándar mayores que cuando se trabaja con ADN nuclear, lo cual debe considerarse al realizar los análisis (Monteiro 1995).

Los análisis de RFLPs también pueden llevarse a cabo con ADN nuclear de cadena sencilla o con secuencias repetidas como el ADN de los ribosomas. Adicionalmente, con secuencias hipervariables como los minisatélites. Estos últimos son repeticiones en grupo de secuencias relativamente cortas -20 pares de bases.- dispersos a través de todo el genoma. Estas secuencias varían dentro y entre subespecies de insectos y en la actualidad constituyen uno de los métodos mas utilizados para estudios de genética de poblaciones en insectos. Así mismo, son de gran utilidad los microsatélites, secuencias repetidas muy cortas -dos a cinco pares de bases- que exhiben las tasas mas altas de cambio en el número de copias y que se han utilizado especialmente para estudios de diversidad genética y relaciones parentales en insectos (Simond et al., 1994).

Los RFLPs proveen información valiosa sobre la variación dentro y entre poblaciones, niveles de flujo genético, tamaño efectivo de poblaciones, y zonas híbridas. En cuanto a taxonomía por ejemplo, se ha encontrado en Apis mellifera una familia de secuencias llamadas AluI altamente repetidas. Estas secuencias están conformadas por 176 nucleótidos y se encuentran aproximadamente 23.000 copias por genoma haploide. Las diferencias encontradas entre abejas, sugieren que esta familia de secuencias puede ser utilizada como carácter diagnostico para separar subespecies y especies de A. lingüistica, A. mellifera, A. cerana, A. dorsa, A. caucasica y A. scutellata. Otros ejemplos de su aplicación en insectos incluyen la realización parcial del mapa genético de especies de Heliothis, los análisis de genética de poblaciones y relaciones parentales de abejas, diversidad genética y estructura de poblaciones de Melanoplus sanguineus y estudios de esterasas en Culex pipiens. Un análisis de la variación del ADN mitocondrial mediante RFLPs en mariposas de la familia Papilionidae, confirmó los límites tradicionales entre Papilio glaucus y Paplio troilus, pero no entre P. rutulus y P. eurymedon las cuales a pesar de mantener diferencias morfológicas y ecológicas en simpatría, comparten su ADN. Aunque no se habían encontrado híbridos en la naturaleza, se produjeron adultos de ambos sexos en el laboratorio (Marjorie 1994, Parker et al., 1998, Hartl. y Clark 1997).

HUELLA DE ADN Ó ADN “FINGERPRINTING”

Esta técnica sigue esencialmente la metodología de los RFLPs marcados de forma radioactiva como sondas, la diferencia principal es el tipo de sonda usada. Existen dos categorías de esta técnica; una involucra la utilización de sondas homólogas a copias múltiples de ADN. La otra se realiza con base en un número variable de repeticiones VNTRs o minisatélites, los cuales no parecen ser funcionales. Las sondas pueden obtenerse de librerías genómicas de insectos u obtenerse comercialmente. La reproducibilidad y eficiencia de la técnica son altas. Existen sondas multilocus que se utilizan como marcadores dominantes y donde los heterozigotes no son identificados; las sondas para un solo locus pueden detectar codominancia (Marjorie 1994, Hartl. y Clark 1997).

En la literatura aparece descrito un método de amplificación mediante PCR de regiones ricas en VNTRs, llamado Amplificación directa de regiones minisatélites DAMD, aquí se producen patrones hipervariables que detectan uno o muchos locus. La utilidad de esta técnica incluye estudios de genética de poblaciones en clones de afijos, análisis parentales en Hymenoptera y resistencia de afijos a insecticidas. La mayor desventaja de esta técnica es la utilización de protocolos que incluyen material radioactivo. Hasta 1998 no habían aparecido muchas publicaciones usando DAMD en insectos y la versatilidad de la técnica para estudiarlos, esta aun por probarse .

AMPLIFICACIÓN DE FRAGMENTOS POLIMÓRFICOS DE LONGITUD AFLPS

Esta es una modificación del análisis de RFLPs pero con marcadores dominantes. En ésta técnica se determina presencia-ausencia de fragmentos de restricción mas que diferencias en la longitud. Por lo tanto, no es posible deducir de forma rápida la homozigosidad o heterozigosidad de un locus con base en la presencia o ausencia de las bandas. El ADN es sometido a restricción utilizando una enzima con un sitio de reconocimiento común y otra con un sitio particularmente escaso. Adicionalmente, se utilizan oligonucleótidos o “primers” conocidos que funcionan como adaptadores de las secuencias y que se unen sobre los fragmentos de restricción. Posteriormente, se realiza una reacción de PCR radioactiva (con 32P) utilizando cebadores que incluyen tres partes: -una secuencia específica de la enzima de restricción (ENZ) -una de extensión selectiva que determina la especificidad del adaptador a la enzima (EXT,) y –una correspondiente a la secuencia del mismo primer. Los polimorfismos del ADN de los insectos se amplifican y visualizan en geles de poliacrilamida utilizando auto radiografía. Las ventajas principales de esta técnica consisten en que no es necesario el conocimiento previo de las secuencias de ADN de los fragmentos y se amplifican concomitantemente un gran número de fragmentos de restricción (50-100). Esta técnica se ha utilizado muy recientemente para construir mapas genéticos de polilla (Quicke 1993, Simond et al., 1994).

AMPLIFICACIÓN DIRECTA DE POLIMORFISMOS DE LONGITUD DALP

Esta es una técnica muy nueva que mejora la resolución del “fingerprinting”. Permite observar polimorfismos dentro de una misma especie con base en la amplificación mediante PCR. Los polimorfismos observados en un gel de acrilamida pueden secuenciarse directamente una vez detectados. Aunque esta metodología puede ser muy útil para realizar búsquedas rápidas de polimorfismos en genes particulares como los involucrados en la resistencia a insecticidas o relacionados aspectos fisiológicos- no ha sido muy utilizada en insectos debido probablemente a su desconocimiento.

Existen otras técnicas como PCR Trascriptasa reversa, más conocida como cDNA y PCR ELISA que son relativamente nuevas. La primera permite revelar un ARN mensajero y el gen que este expresa. Por ejemplo, en relación con la resistencia a insecticidas es posible convertir el ARN mensajero en ADN copia (cADN) utilizando cebadores adecuados. En insectos la extracción de ARN está bien documentada y es posible utilizar transcriptasa reversa de consecución comercial y amplificar los genes. Además de la identificación de secuencias de ARN de un gen específico, es posible determinar la homología entre genes. Aplicaciones interesantes en insectos incluyen la localización de los genes citocromo P-450 en la mosca doméstica y los genes responsables de revertir el proceso de resistencia a algunos insecticidas en cucarachas y moscas. Así mismo, la detección de patógenos virales en sus insectos hospederos. Una de las principales desventajas de esta técnica es su costo, tres veces superior al de un PCR normal; igualmente que la expresión de un gen puede variar dependiendo del estado de vida en el insecto. (Quicke 1993)

El PCR- ELISA usa una tecnología similar al microplato estándar de inmunoensayos que funciona con base en la especificidad antígeno-anticuerpo. Lo que se marca son los productos de PCR para detectar complementariedad a segmentos específicos de ADN. Los productos coloreados de reacción que indican hibridación se cuantifican en un lector de ELISA. Las aplicaciones principales son para detectar microorganismos en sus insectos vectores y para determinar la existencia de diferentes razas. Los costos son relativamente altos para individuos pero su velocidad y habilidad para estudiar muestras muy grandes y hacer mediciones cualitativas aún en campo, la convierten en una técnica costo-efectiva (Quicke 1993).

HIBRIDACIÓN ADN-ADN

La hibridación que se basa en la complementariedad de las bases que conforman la cadena doble de ADN se utiliza en sistemática molecular de insectos para medir de forma cuantitativa la relación entre especies. Esta medición cuantitativa ha mostrado ser eficiente sólo en el caso de ADN nuclear. El ADN de dos especies puede combinarse mediante ésta técnica. Las moléculas de cadena doble que se forman entre cadenas complementarias de dos especies de insectos contienen puntos exactos de complementariedad relacionados con la divergencia a partir de un ancestro común. La cantidad de pares complementarios determina la temperatura a la cual esas moléculas se unen cuando se colocan en un gradiente de temperatura. Las diferencias en los parámetros de asociación y reasociación de las moléculas se usan para estimar distancias genéticas. Los valores porcentuales de hibridación NPH se usan como una medida de la fracción de ADN separada (Simond et al.,1994, Drew, Parker et al., 1998)

La mayoría de los estudios realizados con esta técnica han sido con Drosophila para determinar magnitudes de variación intra específica. Los límites de la resolución de la técnica dependen del grado de divergencia entre las especies bajo estudio. Como con otras técnicas, ésta presenta limitaciones como son: los altos costos y el uso de radioisótopos (Quicke 1993).

OBTENCIÓN DE SECUENCIAS

Existen varios métodos que permiten conocer la secuencia de nucleótidos del ADN. La determinación de secuencias puede realizarse sin necesidad de construir librerías. Las secuencias pueden obtenerse de clones o directamente de productos de PCR dependiendo del interés de la investigación. La información sobre las secuencias tanto de proteínas como de ácidos nucleicos, se ha desarrollado de forma intensa durante los últimos 40 años (Parker et al.,1998).

Las secuencias pueden usarse para construir filogenias moleculares y mapas genéticos de insectos, evaluar cambios evolutivos, estudiar variación geográfica, resolver problemas taxonómicos a cualquier nivel y entender las bases moleculares de la fisiología de insectos, por ejemplo los mecanismos de respuesta inmune, genes de seda etc. En la actualidad puede obtenerse secuencias mediante métodos automatizados con fluorescencia y sin radioactividad. Aunque es la tecnología de punta, la principal desventaja es su alto costo, en especial para abordar aspectos de genética de poblaciones . (Narang. y Degrugillier 1995, Hartl. y Clark 1997, Smith et al., 1998).

ELEMENTOS TRANSPOSONES, INSECTOS TRANSGÉNICOS

Como se describió al hablar del genoma de insectos, los transposones son elementos móviles en el genoma de los mismos. La transformación genética de elementos como el P inicialmente descrito en Drosophila, revolucionó el estudio de la estructura genética, función, regulación, expresión y desarrollo de este organismo (Quicke 1993).

El elemento P es un elemento trasposable de 2.907 pares de bases que codifica para un polipéptido con actividad transposasa. Se encuentra disperso en el genoma de Drosophila melanogaster en donde se puede encontrar entre 30 y 50 copias de este. Se conoce que la regulación e incluso la supresión de la transposición puede ser suprimida por factores presentes en el citotipo P. Existen otros elementos transposones como el mariner y el hobo los cuales han sido menos estudiados (Quicke 1993, Marjorie 1994).

El movimiento del elemento P causa mutaciones inactivando genes, alterando las tasas de transcripción o alterando el desarrollo y expresión de genes específicos de algunos tejidos. Los movimientos de este elemento también pueden generar ruptura de cromosomas o alteraciones en la separación de cromátidas originando rearreglos cromosomales e incluso muerte de líneas germinales. Este elemento genera un proceso conocido como disgenesis híbrida, que consiste en la presencia de aberraciones cromosomales en la progenie resultante de individuos de machos que contienen el elemento y P y hembras que carecen del.

Después de haber sido clonado el elemento P se ha utilizado mediante ingeniería genética, para insertar ADN exógeno en líneas germinales de Drosophila. La eficiencia de la inserción aumenta si los embriones son micro inyectados. La inserción es conocida como la transformación genética de dichas moscas. El éxito de la transformación depende de numerosos factores y en ocasiones los porcentajes de sobre vivencia de los insectos transformados son bajos (30-50%). Existen muchos métodos para caracterizar los insectos transformados y evaluar la expresión de genes exógenos (Avise 1996, Drew, 1997, Parker et al., 1998).

El ADN exógeno también puede micro inyectarse en embriones de insectos sin utilizar elementos trasposables. En momentos en que las membranas celulares están ausentes o poco definidas como en los primeros estados de clivaje del embrión el ADN inyectado se difunde fácilmente y encuentra el núcleo cuando la membrana nuclear se destruye en las divisiones celulares. Así mismo se realiza microinyección materna o transformación de huevos en hembras grávidas obteniéndose expresión en larvas. También se utiliza electroporación es decir, introducción de ADN exógeno mediante pulsos de campos eléctricos cortos que hacen permeables ciertas membranas. Se han transplantado núcleos y células polares para construir embriones híbridos y se han transformado simbiontes de insectos (Avise 1996, Drew, 1997,.Parker et al., 1998).

Algunos de los proyectos más importantes de manipulación genética de insectos se desarrollan en insectos vectores de enfermedades e incluyen transformaciones relacionadas con la respuesta a temperatura, incapacidad para transmitir los patógenos y parásitos en presencia de factores tóxicos en la hemolinfa o impermeabilidad en las membranas de los intestinos.

Las manipulaciones genéticas de insectos plaga o benéficos y su utilización en programas de manejo de plagas comparten muchos problemas. Tales manipulaciones requieren métodos costosos, eficientes y estables de transformación; así mismo, conocimiento de promotores apropiados y otros elementos que regulan la expresión efectiva del gen que se inserta (Chambers y Baylers, 1983, Brookes, 1997).

El número de genes clonados en insectos y su valor potencial ha aumentado en los últimos años al igual que la controversia sobre su creación y liberación. La liberación de insectos transgénicos requiere un análisis extensivo sobre los riesgos el cual no puede realizarse sin disponer de fuentes adecuadas de tiempo y dinero para sufragar los costos. Aún hacen falta años para llegar al punto en que estos insectos se utilicen libremente por que se desconocen muchos aspectos sobre el comportamiento, biología, ecología y genética de los insectos transformados. Entre algunas de las preocupaciones de la liberación de insectos transgénicos se encuentran la estabilidad de las poblaciones transgénicas, la alteración en los rangos de hospederos, la dispersión y el potencial para persistir en el ambiente. (Avise 1996, Drew, 1997,Smith et al., 1998 , Black et al.,2001).

ALGUNOS OTROS CONOCIMIENTOS DERIVADOS DE LA UTILIZACIÓN DE MOLÉCULAS PARA ESTUDIAR INSECTOS

Determinación de biotipos en insectos y asociación de los mismos con comportamientos particulares como en el caso de trips y otros insectos de notable importancia económica.

Esclarecimiento de la relación planta-insecto en algunas plagas con las implicaciones que de ello derivan.

Precisión sobre el funcionamiento de los mecanismos celular y humoral mediado por proteínas de respuesta inmune en insectos.

El estudio conjunto de factores genéticos, morfológicos, nutricionales y endocrinos ha permitido determinar aspectos de relevancia en entomología y control biológico. Por ejemplo, endocitobiontes como los Poliadnovirus encontrados en Hymenoptera de las familias Braconidae e Ichneumonidae aseguran su capacidad de parasitismo hacia otros insectos. Datos moleculares han permitido comprobar que dichos virus son trasmitidos de forma vertical e integrados en los cromosomas de las avispas.

Conocimiento sobre las bases genéticas de determinación del sexo en insectos, lo que ha permitido avanzar en el control genético de plagas y realizar modificaciones genéticas de microorganismos asociados a insectos.

Progreso en la comprensión de la genética molecular del comportamiento que involucra las actividades de un insecto en relación con el ambiente que lo rodea. Hasta ahora ha sido posible mapear y localizar los genes relacionados con funciones como locomoción, aprendizaje, alimentación, comunicación etc.

Profundización en el conocimiento sobre funcionamiento celular y molecular en relación con los neurotransmisores, los canales de sodio y potasio, la comunicación sexual -sonidos, feromonas- y otros aspectos de relevancia práctica en el control de plagas.

Utilización de marcadores biológicos moleculares de insectos en biología de la conservación, como biomonitores y biomarcadores de cambios evolutivos; por ejemplo, en preservación de la biodiversidad y en restauración de “hábitats”. Esto ha sido posible gracias a la genética de poblaciones y a la descripción de procesos genéticos que ocurren en comunidades, tales como la adaptación a ambientes particulares

Establecimiento de algunas bases genéticas de los patrones macro evolutivos y fuerzas micro evolutivas involucradas en la relación mutualista entre insectos y otros organismos como las hormigas y los hongos que cultivan. (Ehrlich 1984, Bereumam 1986, Drew, 1997 Roehrdanz et al., 1998, Avise 1996, Parker et al., 1998, Clemente et al., 200I)

CONSIDERACIONES FINALES

Es innegable que los métodos moleculares han abierto completamente el mundo de los insectos al escrutinio genético así como el espectro de las escalas de tiempo ecológicas y evolutivas en la diferenciación genética de los mismos. Entre las principales ventajas de utilizar los marcadores moleculares para estudiar insectos se encuentran los altos volúmenes de información primaria obtenidos, la posibilidad de seguimiento en el tiempo, y la posibilidad de realizar estudios en diferentes escalas espaciales.

Aunque muchas descripciones indican la existencia de numerosos marcadores moleculares para estudiar insectos y diversas aplicaciones de la entomología molecular, debe considerarse que en ciertas ocasiones no es necesario incurrir en el uso de técnicas moleculares complicadas y costosas cuando existen versiones más simples y baratas. Por lo tanto, no debe perderse la perspectiva sobre las preguntas biológicas y los objetivos que generan nuestro interés en los insectos.

Existen múltiples aproximaciones al trabajo molecular y hasta cierto punto se espera el desarrollo constante de procedimientos nuevos y mejorados. Esto hace que la escogencia de la técnica molecular a emplearse en cada tipo de investigación deba sustentarse en el tipo de temática que se va a abordar relacionada con las características propias de cada método.

El análisis de la información molecular, dependiendo del punto de partida de cada investigación puede generar o no, cierto tipo de incertidumbres. Elementos como la alineación inicial de las secuencias, la definición y escogencia de los caracteres y sus estados, la escogencia del método analítico y el nivel de confianza sobre los resultados obtenidos, son puntos que merecen especial atención.

En algunos casos las inferencias moleculares han demostrado tener una menor resolución que las obtenidas con caracteres morfológicos y existen inconsistencias entre ambos métodos en casos particulares. Esto último, mas que ser una limitante puede ser visto como una ventaja potencial en términos de complementariedad de la información.

Algunas de las principales desventajas las constituyen los costos ya que la inversión inicial para el montaje de un laboratorio que maneje técnicas moleculares puede considerarse significativa. Por otro lado, se requiere personal de laboratorio cualificado. Sin embargo, esta es en sí una característica de cualquier técnica científica y para el caso particular, los procedimientos básicos pueden ser aprendidos en corto tiempo.

La estandarización de cada procedimiento relacionado con la extracción y purificación del ADN representa el primer escollo en el manejo de las técnicas moleculares. Cada laboratorio presenta características, potencialidades y limitaciones, que en algunos casos solo es posible identificar mediante experimentación repetida.

Aunque existe un enorme progreso en la utilización de moléculas para estudiar insectos existe también un vasto campo por explorar, cuyo desarrollo precisa de entomólogos que consideren Las moléculas como una alternativa real para estudiar los insectos, una realidad comprobada por los numerosos estudios que se desarrollan actualmente en las universidades y centros de investigación del país y el mundo (Chavarriaga y Roca 1994, Hartl. y Clark 1997)

LITERATURA CITADA

ASHBURNER. “Drosophila” : A Laboratory Handbook Cold Spring Harbor Press New York. 1989. 200p.

AVISE, J. C. Introduction: The scope of conservation genetics. En: Conservation genetics. Case histories from nature. AVISE, J.C. y HAMRICK, J.L. (ed.) Chapman & Hall, New York, 1996. p. 1-9.

AVISE, J. C. The unorthodox perspectives on evolution prompted by comparative population genetic findings on mitochondrial DNA. Annual review of genetics. Vol 25, 1991. p. 45-69.

BERENBAUM, M. Postingestive effects of phytochemicals on insects: on paracelsus and plant products. En: Insect-plant interactions. MILLER, J. R. y MILLER, T. A. Springer-Verlag, New York, U.S.A., 1986. p. 121-153.

BLACK, W. C. IV; BAER, CH. F.; ANTOLIN, M. F.; DUTEAU, N. M. Population genomics: Genome-Wide sampling of insect populations. Annual Review of Entomology. Vol. 46, 2001. p. 441-469.

BROOKES, M. I. Genetic analysis of founder blottlenecks in the rare brittish butterfly Plebejus argus. Conservation biology. Vol 11, No 3, 1997. p. 648-661.

CHAMBERS, S. M.; BAYLESS, J. W. Systematics, conservation, and the measurement of genetic diversity. En: SCHONEWALD et al., (eds.). Genetics and conservation. Benjamin/Cumings, California, 1983. p. 349-363.

CHAVARRIAGA, P.; ROCA, W. M. Biotecnología agrícola. Tecnologías de mayor aplicación en instituciones colombianas. GUHL N., E. (Ed.). Medio ambiente y desarrollo. Tercer Mundo-Uniandes, Santafé de Bogota, 1994. p. 209-217.

CLEMENTE, M.; REMIS, M. I.; VILARDI, J. C. Mitochondrial DNA variation in the south american grasshopper Dichroplus elongatus (Orthoptera: Acrididae). Annals Entomological Society of America. Vol 93, No 3, 2000. p. 635-662.

CRAMPTON, J. M. Potential application of molecular biology in entomology. En: CRAMPTON, J.H. y EGGLESTON, P. Insect Molecular Science. 16 Th Symposium of the Royal Entomological Society of London, 1991. p. 3-20.

DREW R. A. The application of biotechnology to the conservation and improvement of tropical and subtropical fruit species. Seed and plant genetic resources service. Food and agriculture organization of the United Nations. Technical paper. Rome, 1997. 74 p.

EHRLICH, P. R. The structure and dynamics of butterfly populations. The biology of butterflies. Academic Press, London, 1984. p. 25-40.

FUTUYMA, D. J. Evolutionary biology. The evolution of behavior. Massachusetts: Sinauer, Sunderland, 1998. 763 p.

HARTL, D. L.; CLARK, A. G. Principles of population genetics. Sinauer, Massachusetts, 1997. 542 p.

LYCETT, G. J. Insect Molecular Genetics Newsletter 4. 1-3 Royal Entomological Society of London Publications 1990 32p.

LOXDALE, H. D.; LUSHAI, G. Molecular markers in entomology. Bulletin of Entomological Research. Vol 88 No 6, 1998 .

MARJORIE A. H. Insect Molecular Genetics. USA. Academic Press. 1994. 540 p.

MONTEIRO, F. A.. Mitochondrial DNA variation of Triatoma infestans populations and its implication on the specific status of T. melanosoma. En: Memorias do Instituto Oswaldo Cruz 1995. Suppl. I: p. 229-238

NARANG, S. K.; DEGRUGILLIER, M. E. Genetic fingerprinting of the specific status of T. melanosoma. En: Memorias do Instituto Oswaldo Cruz 1995. Suppl. I: p. 229-238

NARANG, S. K.; DEGRUGILLIER, M. E. Genetic fingerprinting of the screwworm (Diptera:Calliphoridae) Infestation in North Africa by Mitochondrial DNA markers. Florida Entomologist. Vol 78 No 2, 1995. p. 294

PACHAMUTU, P.; KAMBLE, S. T.; CLARK,T. L.; FOSTER, J. E. Diferentiation of three phenotypically similar Blatella spp.: analysis with polimerase chain reaction-restriction fragment lenght polymorphism of mitochondrial DNA. Annals of the Entomological Society of America 1998.

PARKER, P. G.; SNOW, A. A.; SHUG, M. D.; BOOTON, G. C.; FUERST, P. A. What molecules can tell us about populations: choosing and using a molecular marker. Ecology. Vol 79 No 2, 1998. p. 361-382.

POST R. J., MURRAY K. A, FLOOK P. K, MILLEST A: I. 1991. In Molecular Techniques in taxonomy (G.M. Hewit.A.W.Johnson and J. P. Young eds). NATO series.Springer Verlag, Berlin.

QUICKE, D. L. J. Principles and techniques of contemporary taxonomy. Chapman & Hall, London, 1993. 311 p.

ROEHRDANZ, R. L ;SZALANSKI, A. L.; POWERS, T. O. Genetic variation in western, Mexican and northern corn rootworms, Diabrotica sp. (Coleoptera: Chrysomelidae). En: Keysotone Symposia: Toward the genetic manipulation of Insects. 1998. p. 35.

SMITH, P. T.; KAMBHAMPATI, S.; VOLK, W.; MACKAUER, M. A phylogeny of aphid parasitoids (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae) inferred from mitochondrial NADH 1 dehydrogenase gene sequence. En: Molecular Phylogenetics and Evolution (in press), 1998. [en línea]

WATSON J: D., HOKINS J. W, ROBERTS J. A., STEIZT A. M., WEINER.. Molecular Biology of the gen. Vols I, II, 4th.Ed. Benjamin/Cummings, Menlo Park, CA. 1987

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